Neurogênese usando células de Carcinoma embrionário P19
Summary
A linha celular da carcinoma embrionária do rato P19 (linha celular P19) é amplamente utilizada estudando o mecanismo molecular da neurogênese com grande simplificação comparada à análise in vivo. Aqui, nós apresentamos um protocolo para o neurogênese ácido-induzido retinóico na linha celular P19.
Abstract
A linha celular P19 derivada de um teratocarcinoma embrião-derivado do rato tem a habilidade de diferenciar-se nas três camadas do germe. Na presença de ácido retinóico (RA), a suspensão cultivada linha celular P19 é induzida para diferenciar em neurônios. Este fenômeno é extensivamente investigado como um modelo de neurogênese in vitro. Portanto, a linha celular P19 é muito útil para estudos moleculares e celulares associados à neurogênese. Entretanto, os protocolos para a diferenciação neuronal da linha celular de P19 descritos na literatura são muito complexos. O método desenvolvido neste estudo é simples e vai desempenhar um papel na elucidatação dos mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.
Introduction
Durante o desenvolvimento embrionário, uma única camada de células é transformada em três camadas germinativas separadas1,2,3. Para aumentar as possibilidades de pesquisa de fenômenos ocorridos in vivo, a geração de agregados tridimensionais (corpos embrionários) tem sido desenvolvida como um modelo conveniente. Agregados celulares formados dessa forma podem ser expostos a várias condições que causam diferenciação celular, o que reflete o desenvolvimento do embrião4,5. A linha celular de Carcinoma embrionário P19 murino (linha celular P19) é comumente utilizada como modelo celular para estudos de neurogênese in vitro6,7,8. A linha celular P19 apresenta características de células-tronco pluripotentes típicas e pode diferenciar-se em neurônios na presença de ácido retinóico (RA) durante a agregação celular seguida de crescimento de neurite condições aderentes. Além disso, a linha celular P19 não diferenciada também é capaz de formar células do tipo músculo e cardiomiócitos a influência do dimetil sulfóxido (DMSO)9,10,11,12.
Muitos métodos13,14,15,16 foram relatados para a diferenciação neuronal, mas a metodologia é às vezes complicada e nao fácil de agarrar somente lendo as descrições. Por exemplo, os protocolos às vezes requerem uma combinação do meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com uma mistura de soro de bezerro (CS) e soro fetal bovino (FBS)13. Além disso, os meios usados para o desenvolvimento neuronal são compor frequentemente de suplementos de neurobasal e de B2713,14,15,16. Como tal, os métodos existentes contêm complexidade em sua preparação e nosso objetivo aqui é simplificar os protocolos. Neste estudo, Nós demonstramos que DMEM com FBS pode ser utilizado para manter a linha celular P19 (DMEM + 10% FBS) assim como para o desenvolvimento neuronal (DMEM + 5% FBS + RA). Este método simplificado para a neurogênese usando a linha celular P19 nos permite estudar o mecanismo molecular de como os neurônios são desenvolvidos. Além disso, pesquisas sobre doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, também são conduzidas usando P19 celular linha17,18, e acreditamos que o método desenvolvido neste estudo vai desempenhar um papel na elucidatação da mecanismos moleculares em anormalidades NEURODESENVOLVIMENTAIS e doenças neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um protocolo simples para a neurogênese usando a linha celular P19. Embora muitos relatórios tenham sido publicados a este respeito, uma metodologia detalhada para a indução da neurogênese usando a linha celular P19 permanece obscura. Além disso, utilizou-se um meio DMEM de glicose (4.500 mg/L) de alta simples com 10% de FBS para todo o experimento. Isso nos permitiu realizar o experimento neurogênico de forma amigável e ampliar o uso desse método para o futuro.
<p class="jove_content"…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado financeiramente pelo National Science Centre, Polónia (n º de subvenção. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) e KNOW (Centro Nacional de pesquisa líder) consórcio científico “alimentos saudáveis para animais seguros”, decisão do Ministério da ciência e do ensino superior n º 05-1/KNOW2/2015
Materials
| 6x DNA Loading Dye | EURx | E0260-01 | |
| Agarose | Sigma- Aldrich | A9539 | |
| cDNA synthesis kit | EURx | E0801-02 | |
| DAPI (4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride) | Sigma- Aldrich | 10236276001 | Working concentration: 1 μg/mL |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) with L-glutamine | Lonza | BE12-604Q | |
| Ethanol 99.8% | Chempur | CHEM*613964202 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | EURx | E5050-03 | |
| MAP2 antibody | Thermo Fisher Scientific | PA517646 | Dilution 1:100 |
| PCR reaction kit | EURx | E0411-03 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | DE17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x concentrated without Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17- 517Q | |
| Retinoic acid | Sigma- Aldrich | R2625-50MG | dissolved in 99.8% ethanol; store in -20 °C up to 6 months |
| Secondary Antibody (Alexa Fluor 488) | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Dilution 1:500 |
| Skim milk | Sigma- Aldrich | 1153630500 | |
| TBE Buffer | Thermo Fisher Scientific | B52 | |
| Triton-X 100 | Sigma- Aldrich | T8787-100ML | |
| Trypsin 0.25% – EDTA in HBSS, without Ca2+, Mg2+,with Phenol Red | biosera | LM-T1720/500 | |
| Cell Culture Plastics | |||
| 1 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.01 | |
| 10 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.10 | |
| 100 mm dish dedicated for suspension culture | Corning | C351029 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Sigma- Aldrich | CLS430791-500EA | |
| 5 mL Serological Pipettes | Profilab | 515.05 | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| Cell culture flasks, surface area 25 cm2 | Sigma- Aldrich | CLS430639-200EA |
Referencias
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M., Stern, C. D. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. , 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Biología del desarrollo. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., et al. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway. Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).
- Lin, Y. T., et al. YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway. Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).
- Neo, W. H., et al. MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression. Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).
- Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- McBurney, M. W., Rogers, B. J. Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns. Biología del desarrollo. 89 (2), 503-508 (1982).
- Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).
- Jasmin, D. C., Spray, A. C., Campos de Carvalho, R., Mendez-Otero, Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells. Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).
- Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity. Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).
- Babuska, V., et al. Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation. Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).
- Monzo, H. J., et al. A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells. Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).
- Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity. BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42 (2017).
- Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells. Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).
- Tsukane, M., Yamauchi, T. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).
- Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation. Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).
- Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).
- Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).
- Hamada-Kanazawa, M., et al. Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid. FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).
- Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons. Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051 (2013).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters. Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).
- MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neurociencias. 80 (2), 487-499 (1997).
- Hong, S., et al. Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).
- Wenzel, M., et al. Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells. FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).
- Harada, Y., et al. Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin. Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).
- Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum. Neurociencias. 58 (4), 753-763 (1994).
- Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line. Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).
