Här presenterar vi ett experimentellt protokoll som kan användas för att fastställa bindande samhörighet och läge av växelverkan av etikett-fri fosfolipid-bindande proteinet annexin A2 med immobiliserade solid-stödda lipidmonolager (SLB) genom att samtidigt mäta den massa upptag och de viskoelastiska egenskaperna av proteinet annexin A2.
Dissipativa quartz crystal microbalance tekniken är en etikett-gratis och enkel metod att mäta samtidigt massa upptag och viskoelastiska egenskaperna för absorberas/orörlig massan på sensorn ytor, vilket gör att mätningar av samspelet av proteiner med solid-stödda ytor, såsom lipid lipidmonolager, i realtid och med en hög känslighet. Annexins är en mycket grupp av fosfolipid-bindande proteiner som interagerar reversibelt med den negativt laddade headgroups via samordning av kalciumjoner. Här beskriver vi ett protokoll som var anställd för att kvantitativt analysera bindningen av annexin A2 (AnxA2) till planar lipid lipidmonolager beredd på ytan av en kvarts sensor. Detta protokoll är optimerad för att erhålla tillförlitliga och reproducerbara data och innehåller en detaljerad steg för steg beskrivning. Metoden kan tillämpas på andra membran-bindande proteiner och lipidens kompositioner.
Cellulära membran är mycket dynamiska och komplexa strukturer. En sammansatt blandning av membran lipider, tillsammans med perifert eller intimt associerade membranproteiner, montera till formuläret microdomains. Samordnad tempo-rumsliga organisationen av dessa membran microdomains är involverad i viktiga fysiologiska processer1. Membran microdomain dynamics drivs av samspelet mellan membran lipider samt möjligheten för perifera membranproteiner att erkänna och interagera med lipider berikad i microdomains. Rekrytering av proteinerna till de specifika lipider är ofta uppnås via lipid-erkännande moduler, såsom den pleckstrin homologi (PH) eller C2 domäner2,3. Biofysiska analysmetoder använder modell membran är nyckeln till att förstå grundläggande principer för dessa processer på molekylär nivå.
Annexins, en stor multigene-familj, är välkänd för sin förmåga att binda till negativt laddade membran lipider, huvudsakligen Fosfatidylserin (PS) i en Ca2 +-kontrollerade sätt2. Andra kännetecknande för familjen annexin är förekomsten av ett bevarat strukturella segment, den annexin upprepa, d.v.s. nuvarande fyra eller åtta gånger och hamnar den Ca2 +– och fosfolipid-bindande platser4. Den Ca2 +-beroende lipid växelverkan förlägger annexins i ett perfekt läge att känna och förmedla Ca2 +-medierad signalering till målet membran. Annexins är konsekvent, kunna inducera bildandet av microdomains berikad i kolesterol, fosfatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) P2) och PS, både i cellulära eller konstgjorda membranet system5. Det här protokollet beskriver en metod för att analysera annexin-membran samspelet använder en Quartz Crystal Microbalance försvinnande (QCM-D)6,7,8.
Den grundläggande komponenten i denna microbalance är en oscillerande kristall som fungerar som sensorn ytan. Den adsorption eller bindning av molekyler till sensorn ytan minskar resonansfrekvens (f) proportionellt till ökningen av massan. Om ytan är jämnt belagd med en film, bindningen av ytterligare ämnen kan störa den strukturella integriteten av detta skikt, och sådana förändringar i viskoelasticitet (energi skingrande faktor D) Dessutom kan övervakas. Detta är en utbredd teknik att studera interaktionen mellan proteiner och lipider lipidmonolager. I denna strategi absorberas lipid blåsor på lämpligt belagda sensorn ytan. Lipid lipidens bildandet är gynnsamt på kisel-baserade material9,10, som blåsor ofta inte brista på andra hydrofila ytor, såsom guld11 oxideras efter UV-ozon exponering, TiO212eller Al 2O313. Bristning av de skapar blåsor släpper vattenfasen, leder till karakteristiska förändringar i massa och försvinnande. Generering av solid-stödda lipidmonolager (SLB) av vesikler fusion är enkla och robusta och kan användas för att skapa komplexa modeller som efterliknar cellulära membran.
Dissipativa quartz crystal microbalance är en etikett-fri och känslig teknik. En stor fördel är möjligheten att belägga material som genererar en tillräckligt tunn hinna på ytan, vilket ger ett brett användningsområde inom olika forskningsområden. Protein-membran interaktion har observerats i realtid, och resultaten kan analyseras direkt. Samma sensor yta kan användas i efterföljande mätningar (efter att ha utfört en minimal rengöring som beskrivs i detta protokoll), vilket möjliggör korrekt interna kontroller och en jämförbarhet mellan analyter.
För att besvara frågor om struktur och funktion förhållandet mellan cellulära membran både kvantitativa och kvalitativa, cellbiologi vinsterna oerhört från användningen av biofysikaliska metoder baserade på väl etablerade och ofta används tekniker , inklusive atomic force microscopy (AFM), ytan plasmon resonans (SPR), och QCM-D tekniken anställd här. Vi visade i tidigare studier som annexin proteiner binder i en Ca2 +-beroende sätt till immobiliserade membranet med hög affinitet. Vi använder frekvens och skingrande skiftar i den 7: e övertonen (Δf7) eftersom detta utgör den bästa kompromissen av upptäckt känslighet och svängning stabilitet.
Denna teknik tillåter även en kvantitativ beskrivning av membranprotein interaktionen. AnxA2 bindning till membranet karaktäriseras av positiva kooperativitet som medieras av de bevarade annexin core-domänen och beror på närvaron av kolesterol. De kvantitativa data som erhållits för AnxA2 och AnxA8 redovisas i detalj på annan plats6,8.
Det finns många kritiska steg i detta protokoll. Använda liposomer omedelbart; annars små blåsor kan smälta samman till större blåsor med mindre ytspänning, vilket leder till hämning av lipid lipidens bildandet. Hålla en konstant temperatur under mätningarna. Varje liten avvikelse i temperatur resulterar i en inte försumbar frekvens och försvinnande SKIFT. Undvika luftbubblor; annars systemet är instabilt och kommer inte att upprätta en originalplan.
Sauerbrey ekvationen tillåter direkt omvandling av observerade frekvensen ändras till förändringar i vikt och är därför ofta används. Dock gäller antagandet av en linjär korrelation mellan förändringen i resonansfrekvensen och extra massan endast komponenter bilda en styv och enhetlig film på sensorn ytan. Sauerbrey ekvationen kan inte användas för viskoelastiska adsorbents såsom vatten-rika protein filmer, lipid skikt med ingående vatten, eller ens adsorberat celler. Här krävs mer komplexa matematiska modeller. Därför är det extremt viktigt att samtidigt övervaka förändringar i frekvens och försvinnande. För att upptäcka strukturella förändringar under mätningen, kan ΔD kontra Δf nyckeltal ritas, med en rak linje som anger ingen konfirmerande förändringar.
En stor fördel med denna teknik är möjligheten att använda ett mycket brett spektrum av material som substrat. Dessutom är det en pålitlig och direkt metod för att studera ett brett spektrum av makromolekylära interaktioner, som korrekt bildandet av surface-beläggning filmerna (såsom SLB), samt ytterligare protein-lipid interaktioner, kan övervakas online.
Detta protokoll kan tillämpas på andra membran-interagera proteiner, till exempel BAR domän proteiner19, ERM (ezrin, radixin och moesin) proteinfamiljen som har en viktig roll i membran-cytoskelettet koppling20,21 ,22eller proteiner som innehåller C2 eller PH domäner. Dessutom har ett brett utbud av tillämpningar av denna teknik att studera biologiska material framgångsrikt publicerats, således upprättande QCM som en väl lämpad experimentell plattform att studera interaktioner av mer komplexa makromolekylära församlingar eller ens celler23,24.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den Deutsche Forschungsgemeinschafts under bidrag SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04 och SFB 1348/A11.
Chemicals | |||
Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
DOPC | Avanti | 850375P | |
EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
PiP2 | Avanti | 850155P | |
POPC | Avanti | 850457P | |
POPS | Avanti | 840034P | |
Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
SDS | Roth | 183 | |
Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
Equipment | |||
Extruder Liposofast | Avestin | ||
Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
QSense Dfind | Qsense | ||
Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |