Dynamiska vidhäftning test för funktionell analys av anti vidhäftning terapier vid inflammatorisk tarmsjukdom

Cellrörelse är en hårt reglerad process som är oumbärlig för utveckling och funktion av flercelliga organismer, men är också inblandade i patogenesen av en mängd sjukdomar¹. Nyligen, målsökande processen av immunceller från blodbanan till perifera vävnader har fått allt större uppmärksamhet, eftersom det bidrar till påfyllning och expansion av patogena celler i inflammerade vävnader i immunologiskt medierad sjukdomar^{2 ,3}. I synnerhet har homing visat sig ha betydelse för translationell i inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD). Den terapeutiska anti-α4β7-integrin antikropp vedolizumab stör tarmen homing har visat effekt i stora kliniska prövningar^4,5 och har använts framgångsrikt i verkliga kliniska praktiken^{6,7 , 8}. ytterligare föreningar är sannolikt att följa^9,10. Likaså används den terapeutiska anti-α4-integrin antikroppen, natalizumab, för behandling av multipel skleros (MS)¹¹.

Våra funktionella förståelse av målsökande processen i allmänhet och verkningsmekanismen av dessa terapeutiska antikroppar är i synnerhet dock fortfarande begränsad. Det är väletablerat att homing består av flera steg inklusive cell tjudra och rullande med efterföljande celladhesion leder till fast gripandet följt av trans endothelial migration^12,13. Ovannämnda antikropparna neutralisera integriner på cellytan förhindrar interaktion med addressins på endotelet av kärlväggen. Detta är tänkt att hindra fast cell adhesion^14,15. Ändå vi bara börjar förstå differentiell relevansen av specifika integriner för cell homing av distinkta cell delmängder. Dessutom effekterna av anti-integrin antikroppar på olika cell delmängder och dos-respons föreningar är till stor del okända leder till massor av öppna frågor i fältet av gut homing och anti vidhäftning behandlingar hos IBD.

Därför behövs desperat bekvämt verktyg för att ta itu med sådana frågor. Effekten av anti-integrin antikroppar på integrin-addressin interaktion har hittills huvudsakligen utvärderats genom att bedöma bindande effekt/bindande hämning med flödescytometri eller genom statisk friktion analyser^{16,17 ,18,19,20}, således med skenbara förenkling och avvikelse från fysiologiska situationen. Vi har nyligen etablerat en dynamisk vidhäftning analys för att studera integrin-beroende vidhäftning av mänskliga celler till addressins och effekter av anti-integrin antikroppar under skjuvspänningen². Principen om tekniken har tidigare påvisats med musen celler^21,22. Här, det var anpassad och utvecklad för att ta itu med ovan nämnda translationell frågor, öppna nya vägar att bättre förstå mekanismerna bakom behandling med anti-integrin antikroppar i vivo.

De studier som beskrivs i följande avsnitt har utförts enligt godkännande av den etiska kommittén av den Friedrich-Alexander universitet Erlangen-Nürnberg.

1. beredning av kapillärer

1. Anslut rektangulära kapillärer till gummi slangen genom stretching slangen på ena sidan med liten sax och noggrant infoga kapillären (ca 0.5 cm) i röret. Täta anslutningen mellan kapillär och röret med plast paraffin film.
2. Coat kapillären med 20 µL av addressin (rekombinant Fc chimera; 5 µg/mL addressin, e.g. MAdCAM-1, i coatingbuffert (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) eller den lämpliga isotyp kontrollösning med p20 pipett (vätska kommer tränga sig in kapillären). Sedan försegla den sidan som inte är ansluten till slangen med plast paraffin filma och inkubera i minst 1 h vid 37 ° C. Använd en kapillär fylls endast med beläggning bufferten eller med lämplig isotypen kontroll som negativ kontroll.
3. Ta bort plast paraffin filmen från spetsen av kapillären, tömma beläggning genom att låta den flytande blöt ur kapillären på ett papper handduk och blockera kapillärer för minst 1 h med 20 µL blockerande lösning (1 x PBS med 5% BSA) vid 37 ° C. Försegla den öppna sidan av kapillären med plast paraffin film. Ta inte bort blockerande lösningen innan du fortsätter till mikroskopi.

2. cell isolering, behandling och förberedelse för mikroskopi

Obs: Dessa steg kan utföras under ruvningen perioder nödvändiga för kapillär beredning.

1. Samla in 18 mL Antikoagulerat fullt mänskligt blod med en aseptisk blodinsamling från den kubiska ven av frivilligarbete personer (t.ex. IBD patienter eller friska kontroller) efter informerat samtycke enligt reglementet av lokalen etikkommittén.
   Obs: Detta steg bör endast utföras av utbildad och erfaren vårdpersonal enligt nationella eller lokala föreskrifter.
2. Fyll blodet in i en 50 mL tub och späd till en volym på 35 mL med 1 x PBS. Sedan underfång blod-PBS blandningen med 10 mL täthet lutning medium.
3. Utföra täthet lutning centrifugering för 15 min vid 800 x g och 24 ° C utan broms att separera celler.
4. Samla de perifera mononukleära blodcellerna (PBMC) genom att aspirera vita blodkroppar lagret ovanpå täthet lutning medium lagret (klart mellersta lagret). Överföra PBMC i en färsk 50 mL tub, fyll upp till 50 mL med 1 x PBS och Centrifugera i 10 min vid 300 x g och 10 ° C.
5. Tag bort supernatanten, Återsuspendera cellpelleten i 10 mL 1 x PBS och därefter räkna cell nummer, t.ex. genom att använda en Neubauer cell räknar kammare.
6. Valfritt: För att studera adhesionen av granulocyter utföra följande procedur. Annars fortsätter du med steg 2,7 eller 2,8.
   1. Samla granulocyt lagret (understa lagret efter densitet gradient centrifugering som innehåller också erytrocyterna). Att resuspendera cellerna i 40 mL 1 x PBS. Tillsätt därefter 8 mL 6% Dextran i 1 x PBS, blanda försiktigt och låt celler sediment i 30 min i rumstemperatur.
      Obs: Erytrocyterna kommer att sjunka till botten av röret, medan granulocyterna kommer bo i suspension.
   2. Efter 30 min, samla in supernatanten, överföra till en färsk 50 mL rör och Centrifugera under 6 minuter vid 300 x g - och 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lysera de återstående erytrocyterna genom att tillsätta 5 mL 0,2% NaCl i ddH₂O. Inkubera i 1 min.
   3. Tillsätt 5 mL av 1,4% NaCl i ddH₂O och inkubera i ytterligare en minut. Stoppa hypoton Lys genom tillsats av 20 mL 1 x PBS och Centrifugera i 6 min vid 300 x g och 4 ° C.
   4. Återsuspendera cellpelleten i 10 mL 1 x PBS. Sedan räkna cell nummer med hjälp av en Neubauer cell räknar kammare.
7. Tillval: för att studera adhesionen av PBMC delmängder, rena olika celltyper eller undergrupper (t.ex. CD4⁺ och CD8⁺ T celler eller CD19⁺ B celler) med mikrokulor enligt tillverkarens protokollet eller av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS). Annars fortsätter du med steg 2,8.
8. Centrifugera cellsuspensionen i 10 min på 300 x g och 10 ° C. Avlägsna supernatanten och färga celler med cell tracking färgämne (t.ex. CFSE) enligt tillverkarens anvisningar.
9. Därefter, Centrifugera cellerna för 10 min vid 300 x g, och Kassera supernatanten. Återsuspendera i 1 x PBS, fastställa antalet celler och centrifugera igen i 10 min vid 300 x g.
10. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten färgade i lämplig mängd vidhäftning buffert (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂) för att erhålla en suspension av 1,5 x 10⁶ celler/mL. Lägg sedan till lämplig mängd 100 mM MnCl₂ för att erhålla en slutlig koncentration på 1 mM.
    Obs: Dessa celler är nu redo för mikroskopi.
11. Valfritt: Behandla celler med cytokiner, neutraliserande antikroppar eller andra föreningar. Annars, Fortsätt med steg 3.
    1. Utelämna steg 2.10 och återsuspendera cellpelleten färgade från steg 2,9 i RPMI medium (med 10% FBS och 1% Penicillin/Streptomycin) att få en koncentration av 1,5 x 10⁶ celler/mL.
    2. Pipettera 1 mL av denna cellsuspension i så många brunnar i en 48-väl-plattan som det finns förutsättningar för att analyseras. Alltid förbereda en brunn med obehandlade celler att vara perfusion genom ett obestruket kapillär som negativ kontroll och en brunn med obehandlade celler att vara perfusion via en addressin-belagda kapillär som positiv kontroll.
    3. För behandling med anti-integrin antikroppar, lägga till lämplig mängd antikroppar (t.ex., 10 µg/mL vedolizumab) cellsuspension. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C. För behandling med cytokiner, lägga till lämplig mängd rekombinant cytokin (t.ex. 10 ng/mL CXCL10) att cellsuspensionen. Inkubera i 5 minuter vid 37 ° C.
    4. Efter inkubation, skörda celler genom omblandning celler flera gånger med p1000 pipett. Överföra celler i en 2 mL tub, skölj väl igen med 1 mL 1 x PBS och tillsätt 2 mL röret. Bestämma antalet cell.
       Observera: Inkubation av fastsittande cellpopulationer (t.ex. monocyter) kan kräva ytterligare åtgärder (t.ex., behandling med trypsin) att lossa cellerna från plattan.
12. Centrifugera celler för 10 min vid 300 x g vid 10 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i lämplig mängd vidhäftning buffert för att erhålla en suspension av 1,5 x 10⁶ celler/mL. Lägg sedan till lämplig mängd 100 mM MnCl₂ för att erhålla en slutlig koncentration på 1 mM. När förbehandling med chemokiner Lägg inte MnCl₂ cellsuspension. Dessa celler är nu redo för mikroskopi.
    Obs: Minsta volymen används för analysen är beroende av pump och slangar används. I denna studie, med hjälp av den peristaltiska pumpen och slangen anges i Tabell för material, krävdes en minsta volym på 400 µL. Om önskad och tillämpligt (beroende på celltyp och avkastning), kan cellkoncentrationen i suspensionen ökas för att mäta högre vidhäftning på kortare tid.
13. Potentiella modifiering: konkurrenskraftiga dynamiska vidhäftning test
    1. De ovan nämnda stegen med olika cellpopulationer att jämföras med varandra (t.ex. reglerande och effektor T-celler som isolerats genom magnetiska pärla isolering efter tillverkarens anvisningar enligt steg 2,7).
    2. Fläcken varje befolkning med ett annat färgämne (t.ex. CFSE och FarRed) enligt beskrivningen i steg 2,8 – 2,9 kunna skilja cellpopulationer under mikroskopi.
    3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera färgade cellen pellets i lämplig mängd vidhäftning buffert (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl₂ + 1 mM CaCl₂) för att erhålla en suspension av 1,5 x 10⁶ celler/mL.
    4. Blanda lika stora volymer av de cellsuspensioner (t.ex. 500 µL av regulatoriska T-celler) och 500 µL av effektor T-celler att erhålla en slutlig blandad cell koncentration av 1,5 x 10⁶ celler/mL. Lägg sedan till lämplig mängd 100 mM MnCl₂ för att erhålla en slutlig koncentration på 1 mM. Sådana indragningar kan därefter användas för konkurrensanalys av vidhäftning processen av startas olika cellpopulationer genom samma kapillären.

3. levande Cell avbildning av dynamiska vidhäftning

1. Slå på mikroskopet och välja lämpliga filter eller laser för att excitera cellen spårning dye(s) (t.ex. 488 nm laser för CFSE), ett lämpligt mål (t.ex. 40 X) och ett förvärv läge möjliggör tid förflutit imaging.
2. Ta bort plast paraffin filma från spetsen av kapillären och Anslut kapillären med en bit slang (ca 5 cm i längd) genom stretching slangen på ena sidan med liten sax och noggrant infoga kapillären (ca 0,5 cm) i röret. Täta anslutningen mellan kapillär och röret med plast paraffin filma.
3. Montera kapillären på en fixering bricka (t.ex. lock från en 6-well platta med en rektangulär utstansade något kortare än längden på kapillären) och placera fast kapillären på brickhållaren av mikroskopet, så att kapillären är i fokus och klar för mikroskopi.
4. Sätt gummi slangen i motsvarande skåran på den peristaltiska pumpen och placera i slutet som inte kopplade till kapillären i enligt prov röret som innehåller cellsuspension. Infoga det korta röret på andra sidan av kapillären i en 15 mL tub att samla genomflöde.
5. Låta slangen fylla med en flödeshastighet av 500 µL per minut tills cellsuspensionen nästan når kapillären. Sedan låta kapillär fylla med en flödeshastighet av 100 µL/min.
   Obs: En snabb påfyllning av kapillären garanterar en vanlig fördelning av cellsuspensionen inuti kapillären.
6. När kapillären är fylld med cellsuspensionen, justera flödeshastigheten till 10 µL/min.
   Obs: Dessa flöden kan variera när kapillärerna i en annan storlek eller annan Peristaltiska pumpar används. I denna studie var flödet klassar av 10 µL/min optimerad för pumpen och kapillärerna att efterlikna i vivo blodflödet.
7. Fånga time-lapse bilder av cellerna rör sig långsamt genom kapillären längs den addressin-belagd insida vägg varje 2 s för totalt 3 min.
   Obs: Total tid och intervall kan variera beroende på celltyp och frågan tas upp.
8. Innan kasta kapillären, skärmen hela kapillären genom ögat bit av mikroskopet se till att avsnittet visas i videon är representativt. Om det behövs, göra en andra inspelning.
9. Gratis slangen från pumpen och låt den återstående vätskan springa tillbaka in i 2 mL röret, och sedan koppla bort kapillär och slangar från fixering facket och fortsätta med nästa kapillären.

4. utvärdering och Cell räknar

1. Öppna time-lapse sekvensen med lämplig programvara och exportera de tre första bilderna (”början”) och de tre sista bilderna (”slut”) som Tiff-filer.
2. Öppna de tre ”början” bilderna i ImageJ, konvertera till 32-bitars ('bild | Typ | 32 bit') och koppla bilder (' bilden | Färg | Sammanfoga kanalernas; tilldela färgerna rött, grönt och blått till de olika bilderna). Omvandla sammansatt bild till RGB (' bilden | Type-RGB') och Spara som Tiff-fil. Upprepa med ”End” bilder.
   Obs: I konkurrenskraftiga dynamiska vidhäftning analyser med celler som färgas med olika färger, först upp kanalerna för bilderna att analysera adhesionen av de olika cellpopulationer separat.
3. Räkna de vita cellerna visas i ”början” och ”slutet” sammansatt och subtrahera antalet vita blodkroppar i ”början” från vita celler i ”slutet”.
   Obs: Den skillnad representerar antalet nyligen följa celler i 3 minuters tidsintervall. I den sammansatta bilden är celler som flyttats synliga i den specifika färgen som har tilldelats respektive ramen eftersom de lokalisera på en annan plats i den föregående och följande ram. För celler som är anhängare, de röda, gröna och blå signalerna i samma plats överlappningen till vitt.
4. För att bättre visualisera resultaten, kompilera en video från den time-lapse sekvenser, t.ex., använder ImageJ.

Metoden presenteras i detta manuskript syftar till att simulera processen i vivo av mänsklig celladhesion på endotelceller väggen så nära som möjligt till funktionellt bedöma celladhesion och rollen av störande antikroppar. Ultratunna kapillärer är därför belagda med addressins och perfusion med fluorescently märkta mänskliga celler av intresse med hjälp av en perfusion pump. Med levande cell imaging adhesionen av mänskliga celler till addressins kan observeras i realtid (figur 1).

Denna metod är särskilt lämplig för att klarlägga mekanismerna bakom anti vidhäftning terapier i IBD. Som visas i figur 2A, leder perfusion av kapillärer belagd med ICAM-1, VCAM-1, MAdCAM-1 och isotypen Fc chimera med mänskliga PBMC till markant vidhäftning, när en av de tre addressins är närvarande. Däremot är vidhäftning till isotyp-belagd kapillärer minimal. Hämning av integrin-addressin interaktioner med neutraliserande antikroppar vanligtvis leder till en markant minskning av dynamiska vidhäftning som är frånvarande, när isotypen kontroll antikroppar läggs (olikt illustrerade i figur 2B, poolade kvantitativa data i figur 2 c).

Likaså kan effekterna av kemokinerna integrin affinitet modulering undersökas i detta system av före inkubering med sådan peptider in vitro. Som framgår av representativa data i figur 3, behandling av CD4⁺ human T-celler med antingen CCL2 eller CXCL10 leder till ökad vidhäftning till MAdCAM-1 jämfört med obehandlade mänskliga celler.

Figur 1: Schematisk bild av arbetsflödet. Beredning av addressin belagda ultrathin kapillärer och fluorescently märkt mänskliga celler (vänster) följs av perfusion av celler via kapillären använder en Peristaltisk pump (mitten) och time-lapse mikroskopi (höger). Modifierad med tillstånd från referens²³. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: dynamiska vidhäftning av människans perifera mononukleära celler blod (PBMC) från kontroll givare till olika addressins. (A) antal nyligen följa PBMC till kapillärerna belagd med specifika addressins eller med Fc-isotyp kontroll (n = 6). (B) representativa bilder av dynamiska vidhäftning i ICAM-1 belagd kapillärer perfusion med obehandlad (NT) PBMC eller cellerna inkuberas med 10 µg/mL anti-CD18 antikropp eller 10 µg/mL IgG isotypen kontroll. Början: Samman tre första bilder av 3 min sekvens; Slut: Sammanslagna senast tre bilder av 3 min sekvens; vidhängande celler skildras vit. Deras nummer samt skillnaden (dvs nyligen vidhängande celler) indikeras. Skalstapeln = 100 µm. (C) inverkan av anti-integrin antikroppar (varje används vid en koncentration på 10 µg/mL) på dynamiska vidhäftning. Vänster: Numrera av nyligen vidhängande celler till kapillärerna belagda med ICAM-1 och perfusion med obehandlad, anti-CD18-behandlade eller IgG isotypen kontroll-behandlade celler; Mitten: Numrera av nyligen vidhängande celler till kapillärerna belagda med VCAM-1 och perfusion med obehandlad, behandlats med natalizumab eller IgG isotypen kontroll-behandlade celler; Höger: Numrera av nyligen vidhängande celler till kapillärerna belagda med MAdCAM-1 och perfusion med obehandlad, behandlade med vedolizumab eller IgG isotypen kontroll-behandlade celler (n = 5 – 6). Staplarna visar medel med standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Statistiska tester utfördes med envägs ANOVA följt av Newman-Keuls flera jämförande test (* p < 0,05; ** p < 0,01). Modifierad med tillstånd från referens²³. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Chemokine-medierad dynamiska vidhäftning av mänskliga CD4⁺ T cells MAdCAM-1. Bilder från en representativ dynamiska vidhäftning test i MAdCAM-1-coated kapillärer perfusion med obehandlad (NT) CD4⁺ T celler eller celler inkuberas med 10 ng/mL rhCXCL10 eller 100 ng/mL rhCCL2. Början: Samman tre första bilder av 3 min sekvens; Slut: Sammanslagna senast tre bilder av 3 min sekvens; vidhängande celler skildras vit. Deras nummer samt skillnaden (dvs nyligen vidhängande celler) indikeras. Skalstapeln = 100 µm. preinkubation med chemokiner leder till ökad dynamisk vidhäftning, förmodligen på grund av integrin affinitet modulering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

SupplementaryVideos: filmer från tre minuter bildsekvenser från MAdCAM-1 belagd kapillärer perfusion med fluorescently märkta PBMC. (A) kapillär perfusion med obehandlade celler. (B) kapillär perfusion med celler behandlas med 10 µg/mL vedolizumab. (C) kapillär perfusion med celler behandlas med 10 µg/mL humant IgG isotypen kontroll. Cellen flöde från botten till toppen, nyligen följa celler markeras med vita pilar. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Det ovannämnda protokollet beskriver en användbar teknik för att studera dynamiska vidhäftning av mänskliga immunceller till endotelceller ligander. Genom variation av de belagda liganderna eller delmängder, inkubation med ytterligare stimuli eller olika neutraliserande antikroppar perfunderade celltyper, det har nästan obegränsade potentiella tillämpningar. Sådana dynamiska vidhäftning analyser kan därför användbar besvara både grundläggande frågor av såväl grundforskning som translationell frågor som kan bidra till att utveckla och optimera klinisk behandling med läkemedel som stör processen vidhäftning.

Nyttan av analysen att undersöka effekterna av klinisk anti vidhäftning terapier har nyligen påvisats. Olika cellpopulationer att uttrycka olika typer och mängder av integriner visar dessutom konsekvent nivåer av dynamiska vidhäftning till den respektive addressins, stödja giltigheten av den assay²³.

På det hela, slutförandet av protokollet behöver ca 6 timmar av arbete och presenterar mellanliggande tekniska utmaningar. När beläggning av kapillären har startat, är en viktig fråga att undvika uttorkning. Detta kräver noggrann tätning under inkubationsstegen och varsam hantering av kapillärerna, vid utbyte av lösningar. Dessutom kräver inledandet av perfusion processen viss försiktighet. På grund av döda volymen av slangen är det inte möjligt att fylla hela slangen med slutliga perfusion flödet. Däremot, innebär ändra flödet efter spolning kapillären med hög hastighet risker för flöde avbrott leder till möjligheten av statiska friktionskoefficienten begränsning av giltighet när det gäller dynamiska vidhäftning. Därför är lägligt växel till slutliga flödet viktigt. Det slutliga flödet bör väljas beroende på pump, slang och kapillär storlek används. För att efterlikna mänskliga blodflödet i hög endoteliala venules som nära som möjligt, ett volymflöde av 0,1 till 5 rekommenderas mm/s^24,25.

Svårigheten att analysen kan markant öka, när ändringar tillämpas. Analys av specifika T-cell delmängder kan exempelvis kräva krävande polarisering eller rening strategier²⁶. Också, inklusive homing stegen tjudra, rullande och cell aktivering¹² i experimentet kommer att ytterligare öka svårigheten, eftersom det kan vara nödvändigt att belägga en kombination av ligander till insidan av kapillärer eller (före) behandla den perfusion cell befolkningen med kemo- eller cytokiner redogöra för selektin-beroende rullande och chemokine-inducerad cell aktivering och integrin affinitet modulering²⁷. Men dessa kan vara särskilt intressanta frågor för framtida forskning, särskilt som presenterade tekniken gör att funktionellt åtgärda sådana en sofistikerad interaktion av olika molekyler med mänskliga celler och ligander. Som nämnts ovan, konkurrenskraftigt analysera dynamiska vidhäftning av flera annorlunda färgade cellpopulationer i samma kapillär kan lägga till en annan nivå av komplexitet. Dessutom har det också visats att endotelceller kan användas i fluidic system i stället för rekombinant ligander²⁸.

Även om det är en funktionell analys, är tekniken begränsad av minskningen av komplexa i vivo nätverk till en vald uppsättning inblandade molekyler i vitro. Detta innebär att effekterna av okänd eller oväntade ytterligare faktorer kan förbises eller inte tillräckligt beaktas. Dock är detta ett vanligt problem i mänsklig forskning, eftersom etiska överväganden ofta förbjude mekanistiska i vivo utredningar²⁹.

Detta protokoll sammantaget och presenterar en funktionell analys för analys av integrin-beroende dynamiska vidhäftning och anti-integrin terapier i inflammatoriska tarmsjukdomar. Medan den grundläggande principen är ganska rättfram och inte alltför svårt att utföra, kan smyckas det och modifierade i flera avseenden och har potential att besvara translationell frågor angående anti vidhäftning terapi vid IBD.