אדהזיה דינמי Assay לניתוח פונקציונלי של טיפולים למניעת הידבקות במחלות מעי דלקתיות
Summary
אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים לקיר כלי הוא תנאי הכרחי בטן יונת. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול עבור assay פונקציונלי במבחנה לניתוח ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין, נוגדנים או גורמים אחרים על הדבקה תא דינמי של תאים אנושיים באמצעות addressin מצופים נימים.
Abstract
יונת הבטן של תאים חיסוניים חשוב בפתוגנזה של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). אינטגרין תלויית התא הדבקה על addressins שלב חיוני בתהליך זה, אסטרטגיות טיפוליות המפריעים אדהזיה הוקמו בהצלחה. הנוגדן אינטגרין anti-α4β7, vedolizumab, משמשת לטיפול קליני של מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) ותרכובות נוספות נוטים לעקוב.
הפרטים של ההליך אדהזיה ו את מנגנוני הפעולה של נוגדנים אנטי-אינטגרין עדיין אינם ברורים בנוגע רבים בשל השיטות הזמינות מוגבל לחקר תפקודית בתחום זה.
כאן, אנו מציגים וזמינותו אדהזיה דינמי עבור ניתוח תפקודי של התא האנושי אדהזיה תחת תנאי זרימה וההשפעה של טיפולים אנטי-אינטגרין בהקשר של מחלת המעי הדלקתי. הוא מבוסס על זלוף תאים אנושיים הראשי דרך נימים addressin מצופה זכוכית ודק במיוחד עם ניתוח מיקרוסקופי בזמן אמת. וזמינותו מציע מגוון רחב של הזדמנויות עבור ליטושים והשינויים ומחזיק פוטנציאל תגליות מכניסטית ויישומים translational.
Introduction
תא תנועה הוא תהליך מוסדר בחוזקה לארגונה ההתפתחות והתפקוד של אורגניזמים רב תאית, אך הוא גם מעורב בפתוגנזה של שפע של מחלות1. לאחרונה, תהליך הביות של תאים חיסוניים של זרם הדם אל רקמות היקפיים צברה תשומת לב גדלה והולכת, מאז היא תורמת חידוש מלאי והרחבה של תאים פתוגניים ברקמות דלקתי במחלות immunologically בתיווך2 ,3. בפרט, יונת הוכח שיש רלוונטיות translational במחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי). טיפולי אנטי-α4β7 אינטגרין נוגדן vedolizumab הפרעה המעיים יונת הראה יעילות בניסויים קליניים גדולים4,5 , נעשה בהצלחה בעולם האמיתי הקלינית6,7 , 8. תרכובות נוסף נוטים לעקוב אחר9,10. באופן דומה, הנוגדן אינטגרין טיפולי אנטי-α4, natalizumab, משמשת לטיפול של טרשת נפוצה (MS)11.
אולם, שלנו פונקציונלי להבנת תהליך הביות באופן כללי, מנגנון הפעולה של נוגדנים טיפולית כזה בפרט הוא עדיין מוגבל. היא מבוססת היטב כי יונת כוללת מספר שלבים לרבות תא tethering, מתגלגל עם תא עוקבות אדהזיה שמוביל המשרד מעצר ואחריו טרנס ההעברה אנדותל12,13. הנוגדנים הנ ל לנטרל אינטגרינים על פני התא מניעת אינטראקציה עם addressins על אנדותל של הקיר כלי. זה נחשב לעכב תא המשרד אדהזיה14,15. ובכל זאת, אנו רק מתחילים להבין את הרלוונטיות דיפרנציאלית של אינטגרינים ספציפי עבור תא אירוח של קבוצות משנה נפרדות תא. יתר על כן, ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין על שונים תא קבוצות משנה ואינם שיוכים מנה-תגובה במידה רבה ידועים שמוביל המון שאלות פתוחות בתחום של טיפולים ביות והצמדות אנטי-בטן ב מחלת המעי הדלקתי.
לכן, כלי עבודה נוחים כדי לטפל שאלות כאלה יש צורך נואשות. ההשפעה של נוגדנים אנטי-אינטגרין על האינטראקציה addressin-אינטגרין עד כה בעיקר יוערכו על-ידי הערכת יעילות/איגוד מחייב עיכוב עם cytometry זרימה או דרך הידבקות סטטית מבחני16,17 ,18,19,20, ובכך עם פישוט לכאורה, סטייה במצב פיזיולוגי. לאחרונה הקמנו assay אדהזיה דינמי ללמוד תלויי-אינטגרין הידבקות של תאים אנושיים כדי addressins ואת ההשפעות של נוגדנים אנטי-אינטגרין תחת גזירה2. העיקרון של הטכניקה הוכח מקודם עם העכבר תאים21,22. . כאן, זה היה הותאם ופיתח להתייחס אל כל השאלות translational שהוזכרו לעיל, הפתיחה השדרות רומן טוב יותר להבין את המנגנונים של טיפול עם אנטי-אינטגרין נוגדנים ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מתאר טכניקה שימושית ללמוד אדהזיה דינמי של תאים חיסוניים אנושי כדי ליגנדים אנדותל. דרך וריאציה על ליגנדים מצופה, סוגי תאים perfused או קבוצות משנה, דגירה עם גירויים נוספים או נטרול נוגדנים שונים, הוא כמעט בלתי מוגבל של יישומים אפשריים. לכן, מבחני אדהזיה דינמי כזה עשוי להיות שימוש?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר של CN, IA, מחוברים MFN SZ נתמך על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF), תוכנית ELAN את אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג, Kröner-Fresenius-Stiftung אחר, פריץ-בנדר-Stiftung, קרוהן, גרמנית ו קוליטיס קרן (DCCV), טופס קבוצת מחקר קליני של הגרמנית למחקר המועצה (DFG), התוכנית נושא DFG על Microbiota, היוזמה שדה המתעוררים את DFG שיתופי מחקר מרכזי 643, 796 and 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
Referencias
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
