Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie
Summary
Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.
Abstract
Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Der Federal Drug Administration genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen und klinischen Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasiv, und mit minimalen Nebenwirkungen verbunden und erschrecken. Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und intrazellulär sammeln. Nachfolgende Lichtbestrahlung induziert reaktive Sauerstoff Spezies Formation, die letztlich zur zellapoptose, Membran-Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz führen. Hier präsentieren wir Ihnen eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine adhärente Zell-Linie. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit verschiedenen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Plattenepithelkarzinom Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Die primären Endpunkt Maßnahme war Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D Durchflusszytometrie gemessen. Es gab eine dosisabhängige Zunahme der zellapoptose nach 30-minütiger Inkubation von 5-Ala. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.
Introduction
Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS), gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Zelle Apoptose induzieren. Die Federal Drug Administration (FDA) genehmigt PDT zur Behandlung von aktinischen Keratosen (AK) und klinische Leitlinien empfehlen PDT als Behandlung für bestimmte nicht-Melanom-Hautkrebs und Akne Vulgaris1,2. Aufstrebenden nicht-dermatologische Anwendungen für PDT sind Behandlung von Magen-Darm-, Prostata- und gynäkologischen Krebserkrankungen3. PDT ist eine vorteilhafte therapeutische Modalität wie niedrige Kosten, nicht-invasive und minimale Nebenwirkungen und Narbenbildung2zugeordnet.
Im ersten Schritt der PDT ist ein PS angewendet und akkumulieren intrazellulär2erlaubt. In den USA ist aktuell 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) häufig zur Behandlung von AKs. Während der Inkubation wird Phase 5-ALA in Protoporphyrin IX (PP-IX) über den Häm-Biosynthese-Weg im eingebauten Zellen3umgewandelt. Krebs und Pre-Krebszellen gesunken Ferrochelatase Aktivität, die das Endprodukt Protoporphyrin IX (PP-IX) umwandelt, Häm. Krebs Zellen ansammeln infolgedessen PP-IX im Vergleich zu normalen Zellen4,5. Diese Anhäufung von PP-IX in Krebs und Pre-Krebszellen im Verhältnis zu dem umgebenden Gewebe ermöglicht eine PDT ein gezieltes Vorgehen mit minimalen Nebenwirkungen zu sein. Lichteinstrahlung führt zu reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation wenn Sauerstoff angeregten Elektronen aus PP-IX annimmt. PP-IX hat eine Spitze Absorption im UV-Spektrum mit kleineren Gipfel während des sichtbaren Lichtspektrums, darunter blau und rot Licht2. ROS-Bildung führen letztlich zu zellapoptose, Membran Störung, mitochondriale Schäden, Immunmodulation, Proliferation von Keratinozyten und Kollagen Umsatz6,7,8,9 , 10.
PDT wurde in den 1970er Jahren entwickelt und ist eine sich entwickelnde therapeutische Modalität3. Das Protokoll FDA-Zulassung für die Behandlung von AKs empfiehlt 5-ALA Haut Inkubation für 14 – 18 h, aber 1 bis 2 h Inkubationen sind weit verbreitet in der klinischen Praxis2. In Vitro, haben wir gezeigt, dass kürzere 15 min 5-ALA Inkubationen Fibroblasten zellapoptose im Vergleich zu unbehandelten Fibroblasten11,12erhöhen können. Darüber hinaus werden neuartige Chlorin, Phthalocyanin und Nanopartikel basierende PSs untersucht, um PDT Wirksamkeit3zu verbessern. Hier präsentieren wir eine in-vitro- Methode für ein Studium PDT in eine anhaftende Plattenepithelkarzinom Zellen. In diesem Protokoll sind SCC-13 Zellen inkubiert mit 0, 0.5, 1.0 und 2 mM 5-ALA für 30 min und photoaktiviert mit 417 nm blaue Licht für 1.000 s. Das primäre Ergebnis Maß ist Apoptose und Nekrose, annexin V und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Durchflusszytometrie gemessen. Dieses Behandlungsprotokoll PDT simulieren soll und kann angepasst werden, um die Anwendung der PDT mit anderen Zelllinien, Photosensibilisatoren, Inkubation Temperaturen oder photoaktivierungen Wellenlängen zu studieren. Vorbereitung der zusätzliche Kontrollgruppen möglicherweise erforderlich, einschließlich ungefärbten, einzelne Fluorophor gebeizt, negative und positive Kontrollen für Durchflusszytometrie. Eine umfassende Überprüfung der Theorie, Protokolle, Versuchsplanung und gating für Apoptose/Nekrose Durchflusszytometrie finden Sie ebenfalls13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gab es ein deutlichen Anstieg der SCC-13 Apoptose nach 30 min Inkubationen von 0,5, 1 und 2 mM 5-ALA gefolgt von 1.000 s von blauem Licht. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unseren bisher veröffentlichten Untersuchungen zeigen, dass 5-ALA Inkubationen von 30 min, gefolgt von blauem Licht Aktivierung führt zu eine dosisabhängige Zunahme des Anteils der fibroblastenzellen Apoptose12, 14.
Diese experimentellen Umgang mit Studium PDT hat Vorteile und Einschränkungen. Die beschriebenen Methoden entsprechen den klinischen Praxis als handelsübliche PS und Lichtquelle dienten. Forscher können die Methoden mit verschiedenen Zelltypen, PSs, Lichtquellen und Bestrahlung Parameter anpassen. Allerdings gibt es Grenzen dieses Ansatzes, da dieses Protokoll für adhärente Zellen kultiviert in einem monomolekularen Film konzipiert wurde. In der klinischen Praxis können Unterschiede im Gewebe Architektur oder Krankheit Pathologie (z.B. Hyperkeratose oder Fibrose) PS Aufnahme verringern oder ein leichtes Eindringen15. Infolgedessen können die Behandlung Dosen und experimentelle Befunde nicht direkt in die klinische Praxis entsprechen. Sphäroid Tumormodellen und Mikrofluidik-Chip sind als Methoden genauer Tumor Mikroumgebungen16,17,18replizieren untersucht worden. Sphäroide haben innere und äußere zelluläre Nischen, die differentiell integrieren die Photosensibilisatoren und heterogener Tumor Architektur darstellen. Andere Forscher haben mikrofluidischen Chips auf Bildschirm Behandlungsbedingungen und vaskuläre Auslieferung von Photosensibilisatoren verwendet. Mikrofluidische Chips können jedoch zu kostspielig oder schwierig zu implementieren für Forscher nicht mit der Technik vertraut sein. Darüber hinaus können Sphäroide und mikrofluidischen Chips nicht die klinische Behandlung von Hautkrebs wider Photosensibilisatoren in denen direkt an die Tumor-Oberfläche ohne vaskuläre Verbreitung angewendet werden. Forscher müssen die vor- und Nachteile der Monolayer Kultur, Sphäroid Tumormodellen und mikrofluidischen Chips für Studium PDT in verschiedenen Krankheiten Systeme zu bewerten. Da gibt es keine Immunzellen oder extrazelluläre Matrix, ist es nicht möglich festzustellen, wie PDT komplexe Zell-Zell-Interaktionen auswirkt. Forscher müssen in Vitro experimentellen Ergebnisse mit Tiermodellen und klinischen Studien bestätigen. Um hohe Inter Test Validität zu erreichen, ist es wichtig, einheitliche Inkubation und Lichtparameter erhalten beim in-vitro- PDT Experimente durchführen.
Temperatur ist bekannt, die Wirksamkeit von PDT19zu ändern. Eine Studie zeigte, dass Zelltod, 5-ALA-Aufnahme, PP-IX Bildung und Freisetzung von Zytokinen durch Inkubation der Zellen mit 5-ALA bei Temperaturen bis auf 44 ° C19verbessert werden können. Inkubation Temperaturen über 44 ° C zu thermisch induzierte Zelltod führen können, und Inkubation Temperaturen unter 20 ° C können nicht führen zu erheblichen 5-ALA-Aufnahme und Akkumulation19. Es wird empfohlen, Forscher PS Inkubationen auf eine Temperatur regulierbare Heizung-Block bei einer konstanten Temperatur zu steuern für potenziell verwirrende thermische Effekten führen. Darüber hinaus ist es wichtig, für eine ausreichende Menge an Zeit, um die Umwandlung von 5-ALA in PP-IX ermöglichen dem Photosensitizer inkubieren. In diesem Protokoll wurden SCC-13 Zellen mit 5-ALA für 30 min inkubiert, die erfolgreich Zelle Apoptose induziert. Wir haben bereits gezeigt, dass eine 10 min Inkubation von 5-ALA Apoptose in Fibroblasten im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle Fibroblasten11,14nicht signifikant erhöhen. PP-IX beginnt in Maus Haut ansammeln, nach 5-ALA für sechs Minuten bei 37 ° c inkubieren ist Daher, nach zehn Minuten 5-ALA Inkubation möglicherweise nicht ausreichend Anhäufung von PP-IX, Zelle Apoptosis20zu induzieren. Es wird empfohlen, eine minimale Inkubationszeit von 20 bis 30 min für 5-ALA basierend auf unseren bisherigen Studien11,14. Forscher müssen möglicherweise Inkubationszeit basierend auf das Labor, Photosensitizer, Zelltyp und klinischer Indikation zu optimieren. Antikörper-Titration und Optimierung-Experimente können für beste Ergebnisse mit Hersteller-Richtlinien durchgeführt werden. Andere Tests von Interesse können nach blauen Licht photoaktivierungen einschließlich Dihydroethidium Fluss durchflusszytometrischen Quantifizierung von ROS durchgeführt werden. 14
Variation in Höhe von Licht pro Flächeneinheit (d. h. Bestrahlungsstärke) geliefert und die gesamten Bestrahlungsdosis (d. h. Fluence) in der photoaktivierungen Phase beeinträchtigen ROS-Bildung und Zelle Apoptosis21. Die Beziehung zwischen Fluence, Bestrahlungsstärke und Zeit kann durch die folgende Gleichung beschrieben:
Fluenz (J/cm2) = Bestrahlungsstärke (W/cm2) x Zeit (s)
Fluenz Zeit abhängig ist, kann Verlängerung oder Verkürzung der photoaktivierungen Phasen Wirksamkeit der Behandlung ändern. Die Bestrahlungsstärke ist proportional zum Abstand zwischen der Lichtquelle und das Zielgewebe im Quadrat. Infolgedessen, wenn das Licht zu weit weg ist, möglicherweise nicht genügend Lichtenergie geliefert, das Zielgewebe begeistern die PS. Alternativ kann die Bestrahlungsstärke um Licht reflektiert die umgebenden Flächen erhöht werden. Daher empfehlen wir leichte Bestrahlungen mit den Zellplatten Kultur gelegt auf eine schwarze Fläche, Lichtreflexion zu verhindern. Forscher können kommerziell verfügbar oder FDA-zugelassene blaue Leuchtdioden und fluoreszierende Geräte für Versuchszwecke PDT erwerben, sondern diese Geräte möglicherweise verschiedene Leistungsstufen und Lichtfeld Einheitlichkeit. Eine Wellenlänge-spezifischen Photometer sollte verwendet werden, um die Bestrahlungsstärke auf der Zelloberfläche und Gleichmäßigkeit des Lichtfeldes vor jedem Experiment für konsistente Ergebnisse zu messen. Ein handelsüblicher Diffusor kann zur Feld Einheitlichkeit zu erhöhen bei Bedarf.
Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir einen in-vitro- Ansatz für die Untersuchung von PDT durch Detaillierung Theorie, experimentelle Methoden, Einschränkungen, potenzielle Fallstricke und Empfehlungen für die Optimierung beschrieben. PDT ist eine nützliche klinischen Verfahren und in-vitro- Forschung für die Entwicklung von neuartigen PSs, Optimierung von Protokollen und neue Indikationen für PDT erlauben kann.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
Materials
| Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
| DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
| 6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
| PBS | Thermofisher | 14190250 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
| BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
| 5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
| FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
| FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
| FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
| Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
| FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
Referencias
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