פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.
בשנים האחרונות, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבוסס מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה (SMFS) להרחיב את ההבנה שלנו של תכונות מולקולאריות ופונקציות. זה נתן לנו הזדמנות לגלות את ריבוי של מנגנונים biophysical, למשל, adhesins איך חיידקי, לאגד מארח קולטנים משטח בפירוט רב יותר. בין היתר, ההצלחה של ניסויים SMFS תלוי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות ריבית על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים סיליקון משטחים באמצעות silane-פג-carboxyls והכימיה N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) ומבוססת על מנת כדי לחקור את האינטראקציה של pilus-1 adhesin RrgA חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס’ pneumoniae) עם fibronectin חלבון (Fn) מטריצה חוץ-תאית. התוצאות שלנו להראות כי functionalization פני השטח מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על קצה זיז AFM, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך SMFS מדידות חשף כי RrgA נקשר Fn עם כוח רשע של 52 pN. ניתן לכוונן את הפרוטוקול הזוג באמצעות קבוצות אתר ספציפי תיול חינם. זו התוצאה כיוון חלבון או מולקולה מראש והיא מתאים ליישומי biophysical אחרים מלבד SMFS.
לצד פינצטה אופטית, מגנטי,1,(AFM) מיקרוסקופ כוח אטומי2 התפתחה כלי שימושי כדי לנתח ולטפל מולקולות, לחקור את תכונותיהם ואת פונקציות, כולל את תגובתם כוח חיצוני3 ,4. לעומת שיטות כמו וזמינותו immunosorbent מקושר אנזים (אליסה), על פני השטח פלזמון תהודה (SPR) או קריסטל קוורץ microbalance (QCM) כיוונונים, AFM מאפשרת למדוד אינטראקציות על מולקולה בודדת (SMFS)5 , רמת תא בודד (SCFS)6 . טכנולוגיות אלה הניבו יקר תובנה איגוד מנגנונים כמו הקשרים לתפוס לא מצאה את האינטראקציה של e. coli pilus חלבון ש-fimh עם מנוז7או טנדם β-הרוכסן חוזר הנוצרת על-ידי Fn מחייב חלבונים מן S. aureus על איגוד Fn8. הצלחנו לאחרונה מראים את pilus-1 adhesin RrgA9,10 מן חיידק גראם חיוביים pneumoniae סטרפטוקוקוס (ס’ pneumoniae)11 היא היכולת לאגד fibronectin12 עם תחומים מסוף שני שלה. זה התגלה מנגנון מחייב שני-תחום חדש אשר נבדל טנדם β-הרוכסן עשוי לאפשר piliated pneumococci וכושרם משטחים של המארח קשר כדי המכילים fibronectin ארעי13.
להצלחת הניסויים SMFS תלוי באופן ביקורתי הנייח יליד פונקציונלי של מולקולות על משטחים מוצקים וטיפים AFM. כמו כוחות גבוהה עלולה להתרחש במהלך המדידות SMFS, החלבונים כדאי רצוי להיות covalently יחד אל פני השטח. ישנם מספר רב של שיטות צימוד שונה לאימוביליזציה של חלבונים אחרים מולקולות, וכן תאים שלמים על משטחים מוצקים (אורגניים), ננו חלקיקים והתקנים אחרים המתוארים בספרות14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. פרוטוקולים אלה לעתים קרובות לעשות שימוש בחומרים מסוכנים, שקשה לבצע ו/או דורשים ציוד מיוחד (למשל, פלזמה נקי). דרך פשוטה כמה מולקולות הזכוכית היא לצרף שכבה פולימר עבה של heterobifunctional crosslinkers עם קבוצת silane-תגובתי מצד אחד לבין קבוצה אמין-תגובתי בצד השני שלהם. בהתאם ליישום, הסוכנים צימוד יכולות לכלול רשתות הידרו-פחמן גמישה באורך משתנה, למשל., polyethylenglycol (PEG). לדכא את האינטראקציות שאינם ספציפיים של משטחים שונה (למשל, הידרופוביות, אלקטרוסטטית ואינטראקציות ון-דר-Waals) והם עשויים לספק את החופש המסתובבת של מולקולה בשילוב.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כללי עבור המושבים קוולנטיות של חלבונים המכילים אחד או יותר קבוצות אמינו חופשית (-NH2) על זכוכית צף, סיליקון ניטריד AFM טיפים ויה heterobifunctional ethoxy silane-פג-carboxyl (-COOH). פרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים SMFS, אשר הוא דוגמה המבוססת על האינטראקציה של RrgA ושל החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn (ראו איור 1 סקירה כללית).
השלב הראשון הוא silanization של פני השטח28,29,30,31. היא כוללת את הידרוליזה של הקבוצות ethoxy של סוכן צימוד כדי ליצור קבוצות SiOH תגובתי. אלה יכולים להגיב עם קבוצות SiOH על המצע. הריכוז העיקרי צעד, קשרי מימן טופס אלה silanols, על המצע. בתגובה התעבות משנית (אשר בדרך כלל מחייב חום או ואקום להסיר את המים), אגרות חוב siloxane נוצרות. התוצאה היא שכבה אורגניות המצורפת covalently-silane.
השלב השני הוא צימוד של החלבונים פונקציונליות (-COOH) קבוצות אשר להאריך הפולימר32. ראשית, החומצה מומר תגובתי N-hydroxysuccinimid (NHS) אסתר ביניים, אשר הושג באמצעות ומבוססת NHS/EDC (1-אתיל – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid כימיה33 ועוברים התמרה נוקלאופילית סוף סוף לטופס אמיד להיקשר אמינים העיקרי על החלבונים.
בדרך זו, RrgA היה בשילוב סיליקון ניטריד AFM טיפים, Fn אנושי כדי זכוכית מצעים בשנת כיוון אקראי, כוחות האינטראקציה שלהם נותחו על רמת מולקולה בודדת. התוצאות שלנו מראים כי הכימיה השטח המתואר מוביל הפצה הומוגנית של Fn במשטח זכוכית של הריכוז המתאים של RrgA על הטיפ, לכאורה על-ידי ערך היעד של עד 20% מהאירועים אינטראקציה במהלך המדידות SMFS. כימיה זו מפחיתה את האינטראקציות שאינם ספציפיים רקע רלבנטי קטן במהלך איסוף הנתונים, ולכן מתאימה מצוין לניסויים SMFS מדויק.
מאז כניסתה של AFM מבוסס SMFS, זה התפתח טכניקה בשימוש נרחב כדי לחקור ישירות אינטרה ולכוחות הבין-מולקולרי של בודדים חלבונים, חומצות גרעין אחרות4,3,מולקולות5. לניסויים SMFS מוצלח, פני השטח המתאים צימוד אסטרטגיה היא תנאי הכרחי. כדי לחקור את הכוחות התפלגות פולימרים טבעיים וסינתטיים, פולימרים עשוי להיות ישירות מצמידים את המצע השטח ואת AFM עצה36,38,39,40,41. חקירה של האינטראקציות הבין-מולקולריות, כגון המולקולארי, זאת, רצוי להשתמש גמיש מקשר מולקולות כגון הטרו-bifunctional linkers פג או שרשראות מפוליפפטיד, לצרף השותפים לאינטראקציה בין קצה AFM ו משטח המצע, כדי לאפשר הכיוון הנכון של השותפים מחייב, כדי להתגבר על כוחות משטח לטווח קצר וכדי למנוע דנטורציה של התגלגלות של חלבונים21,22,23, 24,25,26,27,42. אנחנו ולכן תיאר עבור הנייח קוולנטיות של חלבונים באמצעות פרוטוקול פשוט וגלוי שלהם אמינים העיקרי נגיש באמצעות מפרידי פג הטרו-bifunctional.
להדגים את תחולתן עם החקירה של האינטראקציה כוחות בין adhesin RrgA מ ס pneumoniae החלבון מטריצה חוץ-תאית Fn, לאחרונה מתוארות בפרוטרוט במקום13.
הכימיה משטח וותיקה, גישות דומות שנותחה שימשו בהצלחה מרובים SMFS ניסויים19,42,43,44,45. Silylether המשמש צימוד הפולימר silane אל פני השטח, כפוף הידרוליזה. מידת הידרוליזה תלויה מידת siloxane נוצר חוב, אשר ניתן לשלוט בתהליך silanization. אם כוחות האינטראקציה גבוהה (≥ 1000 pN) צפויים במהלך המדידות SMFS, silanization צריך להיות שבוצעו באמצעות אדים-שלב העדות30 אשר גורמת להיווצרות של שכבה רציפה של siloxanes. לגבי ניסויים רבים (למשל, חלבונים רבים – אינטראקציות חלבון), כוחות האינטראקציה הן בטווח של כמה מאות pN, ההליך המתואר, אילו siloxane היווצרות הוא בוצע על ידי תצהיר של שלב מימית, לא מאוגדים דשן אורגני מינרלי-חשמל סיליקון בהרהור נשטף עם אתנול (שלב 1.1.7) ואחריו ריפוי עם חום (שלב 1.1.8), מספיקה.
עוד צעד קריטי לשטוף את EDC הנותרים, מולקולות NHS מספיק עמוק (שלב 1.2.3), כמו שאריות יוביל ההפעלה של קבוצות carboxyl על החלבונים. אולי זה גם התוצאה crosslinking של חלבונים על פני השטח אותו, אשר יכול לשנות את הפונקציונליות שלהם או covalently הזוג הפעיל חלבונים חלבונים אחרים על מול פני. זה עלול להוביל מחבר חובק למעקה של החלבונים בין פני השטח הטיפ AFM, דבר המתבטא כוחות להיקרע גבוהה מלווה יכול להיות על ידי תחום התגלגלות (ראה איור 3b, מעקב 1, 4 ו-5, התגלגלות של תחומים Fn)46. אותה בעיה יכולה להופיע, אם האסטרים NHS פעיל של מרווח פג נותרו רוויים. לכן, הדגירה בתמיסת טריס buffered מומלץ (שלב 1.2.6), כמו אמין העיקרי של טריס המרווה הקבוצות הנותרות תגובתי אמינו.
בעקבות פרוטוקול stepwise מוביל בהתפלגות הומוגנית של Fn על הזכוכית silanized אל פני השטח (ראה איור 2) עוזבת צורה dimeric של החלבון. זה דומה Fn´s מבנה בתמיסה, עולה בקנה אחד עם הנתונים הקודמים AFM על משטחים אחרים דוגמת37. בנוסף, הריכוז המתאים של RrgA בקצה AFM מתקבל, אשר יוצרת ערך יעד של ~ 20% של אירועים מוגדרים היטב אינטראקציה במהלך המדידות SMFS (איור 3 ו- 4 באיור). דרך אלגנטית אחרת כדי לקבוע את כמות מולקולות בשילוב בין מדגם המצע ו שלוחה קצה חוץ משתנה הפעמים ריכוז ו/או הדגירה חלבון, הוא השילוב של silane-סוכנים עם קבוצות פונקציונליות שונות משני. על-ידי שינוי היחס בין חלבון קבוצות תגובתי המשתרעת פג-פולימר, מספר חלבונים קיבוע יכול להיות מבוקר15,16,17,18.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כדי לשתק מולקולות המכילות2 אחרות -NH או להתאימם כמה חלבונים אחרים משטח סיליקון-תחמוצת חוץ ניטריד זכוכית וסיליקון. בהתאם לעיצוב חלבון, תגובתי amine הקרבוקסיל ניתן לשנות קבוצה ראקטיבית sulfhydryl (למשל, maleimide או אורתופדיה-pyridyl דיסולפידי) עד כמה את חלבון באמצעות חינם שלו – קבוצות SH. עבור Fn, התוצאה17,13,20כיוון מוגדר מראש.
לסיכום, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשרת דרישות שונות ומתאים עבור יישומים biophysical אחרים מלבד מולקולה בודדת כוח ספקטרוסקופיה ניסויים.
The authors have nothing to disclose.
טרה-בתים ו- HG להכיר תמיכה כספית באמצעות המועצה האירופית למחקר “Cellufuel, גרנט מתקדם מס 294438”. HCS מודה תמיכה כספית ממשרד הפדרלי עבור חינוך ומחקר דרך Technofunktionale Proteine Innovationsallianz (TeFuProt), SS מודה כספי תמיכה ממשרד מדינת בוואריה מדע וחינוך דרך המוקד מחקר “Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe – קנטר”. אנו מודים Hasselberg קוני-כריסטוף, מרטינה Hörig לתמיכה טכנית
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |