Ce protocole décrit l’immobilisation covalente de protéines avec un hétérobifonctionnel agent de couplage silane aux surfaces d’oxyde de silicium conçu pour la spectroscopie de force force atomique microscopie basée seule molécule qui est illustrée par la interaction de RrgA (adhésine pilus-1 pointe de S. pneumoniae) avec la fibronectine.
Ces dernières années, microscopie à force atomique (AFM) a basé la spectroscopie de force seule molécule (SMF) élargie notre compréhension des fonctions et des propriétés moléculaires. Il nous a donné l’occasion d’explorer la multiplicité des mécanismes biophysiques, par exemple, comment bactérienne adhésines et la lier à des récepteurs de surface hôte plus en détail. Entre autres facteurs, le succès des expériences de SMF dépend de l’immobilisation fonctionnelle et native de la biomolécules d’intérêt sur des surfaces solides et des conseils de l’AFM. Nous décrivons ici un protocole simple pour le couplage covalent des protéines sur des surfaces de silicium à l’aide de silane-PEG-carboxyles et la chimie de N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) bien établie dans l’ordre d’étudier l’interaction des adhésines pilus-1 RrgA de la bactérie Gram positive Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) avec la matrice extracellulaire protéines la fibronectine (Fn). Nos résultats montrent que la fonctionnalisation de surface conduit à une répartition homogène des Fn sur la surface vitrée et à une concentration appropriée de RrgA sur la pointe de cantilever AFM, apparente par la valeur de cible de jusqu’à 20 % des événements d’interaction au cours de la SMF mesures et a révélé que RrgA se lie à la Fn avec une force moyenne de 52 AP. Le protocole peut être ajusté pour couple via site spécifique gratuit groupes thiols. Cela se traduit par une orientation prédéfinie de protéine ou d’une molécule et est adapté pour d’autres applications biophysiques outre les SMF.
À côté des pinces optiques et magnétiques, la force atomique (AFM) de microscope1,2 a émergé comme un outil utile pour analyser et manipuler les molécules et sonder leurs propriétés et fonctions, y compris leur réponse à la force externe3 ,4. En revanche de méthodes telles que le dosage immunoenzymatique (ELISA), surface résonance plasmon (SPR) ou configurations de cristal de quartz de microbalance (QCM), AFM permet de mesurer les interactions sur la molécule unique (SMF)5 et niveau unicellulaire (FCS)6 . Ces technologies ont donné de précieuses informations sur les mécanismes contraignants comme les obligations prises trouvées pour l’interaction d’e. coli pilus protéine que FIMH avec mannose7ou le tandem β-fermeture à glissière répète formé par les protéines de liaison des Fn de S. aureus lors de la liaison à la Fn8. Nous avons récemment pu montrer que l’adhésine pilus-1 RrgA9,10 de la bactérie Gram positive Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae)11 est capable de se lier à la fibronectine12 avec ses deux domaines de terminales. Cela a révélé un nouveau mécanisme de liaison de deux domaines qui diffère de la β-fermeture à glissière en tandem et peut permettre des pneumocoques Pili à former et à maintenir un hôte contact contenant la fibronectine transitoire surfaces13.
Le succès des expériences de SMF dépend l’immobilisation fonctionnelle et native de la biomolécules sur des surfaces solides et des conseils de l’AFM. Comme forces élevées peuvent se produire lors des mesures de SMF, les protéines devraient préférablement être par covalence couplées à la surface. Il y a un grand nombre de méthodes de couplage différent pour l’immobilisation de protéines et autres biomolécules, ainsi que des cellules entières sur des surfaces solides (inorganiques), des nano-particules et autres dispositifs décrits dans la littérature14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. Ces protocoles font souvent l’utilisation de substances dangereuses, sont difficiles à effectuer et/ou nécessitent des équipements spéciaux (p. ex., plasma cleaner). Un moyen simple de molécules de couple au verre est d’attacher une couche plus épaisse de polymère de hétérobifonctionnel agents réticulants avec un groupe silane-réactif sur un côté et un groupe amine-réactif sur leurs revers. Selon l’application, les agents de couplage peuvent comporter des chaînes d’hydrocarbures flexibles de longueur variable, par exemple., polyethylenglycol (PEG). Ils suppriment les interactions non spécifiques des surfaces modifiées (par exemple, hydrophobe, électrostatiques et les interactions de van-der-Waals) et peuvent fournir la liberté de rotation de la molécule couplée.
Nous décrivons ici un protocole général pour le couplage covalent des protéines contenant un ou plusieurs groupes aminés libres (-NH2) au verre des surfaces et de nitrure de silicium AFM conseils via un hétérobifonctionnel éthoxy silane-PEG-carboxylique (-COOH). Ce protocole peut être utilisé dans les expériences de SMF, qui est basés sur l’interaction entre RrgA et la protéine de la matrice extracellulaire Fn (voir la Figure 1 pour un aperçu).
La première étape est la silanisation la surface28,29,30,31. Il s’agit de l’hydrolyse des groupes éthoxy de l’agent de couplage afin de former des groupes de SiOH hautement réactifs. Ceux-ci peuvent réagir avec les groupes SiOH sur le substrat. Dans une condensation primaire étape, ces silanols former des liaisons hydrogène et répartis sur le substrat. Dans une réaction de condensation secondaire (qui nécessite habituellement la chaleur ou vide pour éliminer l’eau), liaisons siloxane sont forment. Cela se traduit par une couche de covalence attaché organo-silane.
La deuxième étape est le couplage des protéines de fonctionnement (-COOH) les groupes qui s’étendent de la polymère32. Tout d’abord, l’acide est converti en un ester réactif N-hydroxysuccinimid (NHS) intermédiaire, qui est acquise par le NHS/EDC bien établie (1-éthyl – 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid chimie33 et subit une substitution nucléophile pour finalement former une liaison amide avec des amines primaires sur les protéines.
De cette façon, RrgA a été couplé au conseils AFM NITRURE silicium et Fn humaine à des substrats de verre dans une orientation aléatoire et leurs forces d’interaction ont été analysés au niveau de la molécule. Nos résultats montrent que la chimie de surface décrite conduit à une répartition homogène des Fn sur la surface vitrée et à une concentration appropriée de RrgA sur la pointe, apparente par la valeur de cible de jusqu’à 20 % des événements d’interaction lors des mesures de SMF. Cette chimie réduit les interactions non spécifiques à fond, est sous réserve de modifications peu lors de l’acquisition de données et convient donc parfaitement pour des expériences précises de SMF.
Depuis l’introduction du manuel de vol basé SMF, s’est transformé en une technique largement utilisée pour sonder directement intra et intermoléculaires forces de différentes protéines, acides nucléiques et autres biomolécules3,4,5. Pour les expériences réussies de SMF, une surface appropriée, stratégie de couplage est une condition préalable. Pour sonder les forces intramoléculaires dans les polymères naturels et synthétiques, les polymères peuvent être couplés directement à la surface du substrat et l’AFM pointe36,38,39,40,41. Pour l’étude de leurs interactions, telles que les liaisons moléculaires, cependant, il est conseillé d’utiliser des molécules flexibles linker comme hétéro-bifonctionnels PEG linkers ou chaînes polypeptidiques, pour fixer les partenaires d’interaction à la pointe de l’AFM et la surface du substrat, afin de permettre la bonne orientation des partenaires liaison, pour vaincre les forces de surface à courte portée et d’éviter la dénaturation et déroulement des protéines21,22,23, 24,25,26,27,,42. Donc, nous avons décrit un protocole simple et franche pour l’immobilisation covalente de protéines via leurs amines primaires accessibles à l’aide de hétéro-bifonctionnels PEG entretoises.
Nous avons démontré son applicabilité avec l’enquête de l’interaction des forces entre l’adhésine RrgA de S. pneumoniae et la protéine de la matrice extracellulaire Fn, comme l’a récemment décrit en détail ailleurs13.
La chimie de surface est bien établie et approches analysées et similaires ont été utilisées avec succès dans plusieurs expériences de SMF19,42,43,44,45. Le silylether utilisé pour coupler le polymère de silane à la surface, est soumis à l’hydrolyse. Le degré d’hydrolyse dépend de la quantité de liaisons formées siloxane, qui peut être contrôlé au cours du processus de silanisation. Si les forces d’interaction forte (≥ 1000 AP) sont attendus pendant les mesures de la SMF, la silanisation devrait être effectué via vapor phase dépôt30 qui se traduit par la formation d’une couche continue de siloxanes. Comme pour beaucoup d’expériences (par exemple, plusieurs protéines – interactions protéine), les forces d’interaction sont de l’ordre de quelques centaines pN et la procédure décrite, dans laquelle siloxane formation est effectuée par le dépôt d’une phase aqueuse et non consolidée organo-silanes sont soigneusement lavé avec de l’éthanol (étape 1.1.7) suivie de séchage avec chaleur (étape 1.1.8), est suffisantes.
Une autre étape critique est de se laver l’EDC restant et molécules NHS hors de la surface (étape 1.2.3), comme restes entraînera l’activation des groupes carboxyles sur les protéines. Cela peut-être un résultat dans la réticulation des protéines sur la même surface, qui peuvent altérer leur fonctionnalité ou par liaison covalente couple activée protéines à d’autres protéines à la surface opposée. Cela peut conduire à la fixation des protéines entre la surface et la pointe de l’AFM, qui se traduit par les forces de rupture élevé éventuellement accompagnés par domaine se déroule (voir Figure 3 b, trace 1, 4 et 5, déroulement des domaines Fn)46. Le même problème peut se produire, si les esters de NHS actives de l’entretoise de PEG sont laissés non saturés. Par conséquent, l’incubation avec une solution saline tamponnée de Tris est recommandée (étape 1.2.6), comme l’amine primaire de Tris étanche aminés groupes réactifs restants.
Suivant le protocole progressif conduit à une répartition homogène du Fn sur le verre silanisée surface (voir Figure 2), laissant une forme dimérique de la protéine. Cela ressemble à la structure de la Fn´s en solution et est conforme aux données AFM précédentes sur les autres surfaces d’échantillon37. En outre, une concentration appropriée de RrgA sur la pointe de l’AFM est obtenue, ce qui génère une valeur cible d’environ 20 % des événements d’interaction bien définis lors des mesures de SMF (Figure 3 et Figure 4). Une autre façon élégante pour contrôler la quantité de molécules couplée à la pointe de substrat et en porte-à-faux d’échantillon outre variant les temps de concentration et/ou d’incubation de protéine, est la combinaison de silane-agents avec différents groupes fonctionnels secondaires. En changeant le ratio des groupes réactifs protéiques qui s’étend de la PEG-polymère, le nombre de protéines immobilisées peut être contrôlé15,16,17,18.
Le protocole décrit ici permet également d’immobiliser les autres molécules contenant du2 -NH ou être ajusté aux protéines de couple à toute autre surface d’oxyde de silicium en dehors de nitrure de silicium et de verre. Selon la conception de protéines, la fonction carboxyle réactifs amine peut être changée pour un groupe réactif sulfhydryle (p. ex., maléimide ou ortho-pyridyl disulfure) de coupler la protéine via son libre – groupes SH. Pour le Fn, il en résulte une orientation prédéfinies13,17,20.
En résumé, ce protocole peut être ajusté pour répondre aux différents besoins et est adapté pour d’autres applications biophysiques en plus des expériences de spectroscopie de force seule molécule.
The authors have nothing to disclose.
Tuberculose et HG reconnaissent financièrement par le Conseil européen de la recherche « Cellufuel, Advanced Grant no 294438 ». HCS reconnaît le soutien financier du ministère fédéral pour l’éducation et la recherche par le biais de la Proteine de Technofunktionale Innovationsallianz (TeFuProt), SS reconnaît financial support du ministère d’Etat bavarois pour la Science et l’éducation par l’intermédiaire de l’axe de recherche « Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe – CANTER ». Nous remercions Conny Hasselberg-Christoph et Martina Hörig pour le support technique
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |