כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

אפופטוזיס, או מוות תאים מתוכנת, היא תהליך פיזיולוגי מאוד מווסתות מתרחשת אצל רוב אורגניזמים רב תאיים, הוא קריטי עבור שלהם ופיתוח הומאוסטזיס¹. בנוסף להיות מעורב תחלופת תאים נורמליים ופיתוח עובריים, אפופטוזיס מאפשר חיסול של תאים נגועים או פגומים של רקמות, יכולה להיות מופעלת בתגובה זיהום, דלקת, סרטן, וגם על ידי התערבויות רפואיות כגון הקרנות או סטרואידים¹. מוות תאים לחשוף “לאכול-לי” אותות על פני השטח של התא, אשר מוכרים על ידי רצפטורים על מגוון של phagocytes מקצועי, בלתי מקצועיים, המכונות במקובץ “efferocytes”. האירוסין של רצפטורים אלו המניע את ספיגת והשפלה של התא אפופטוטיים להיפגע על ידי efferocyte באמצעות תהליך המכונה efferocytosis^2,3. Phosphatidylserine הוא הטוב ביותר מאופיין לאכול-לי אות efferocytosis נהיגה. זה בדרך כלל מוגבל העלעל הפנימי של קרום פלזמה, עם אפופטוזיס הפעלה של scramblase שומנים בדם אשר משבש סימטריה קרום זה, ובכך חושף בפני phosphatidylserine על פני השטח התא⁴. Phosphatidylserine נמצא על פני השטח חוץ-תאי של כמה תאים שאינם אפופטוטיים להיפגע, כגון מקרופאגים בוגרת ומופעל טסיות. עם זאת, תאים אלה אינם efferocytosed בשל נוכחותם של “אל תאכל אותי” אותות, כגון CD47,^6,שלהם משטח^5,תא⁷. Phosphatidylserine חשוף מזוהה על ידי מערך של קולטני efferocytic לידי ביטוי efferocytes. איגוד של רצפטורים אלו כדי phosphatidylserine, ישירות או באמצעות הסיוע של opsonins, הפעלת איתות המסלולים המקדמים את היבלעות של התא אפופטוטיים להיפגע לתוך חלולית ממברנה מכורך כינה את efferosome^{8, 9 , 10 , 11 , 12}. efferosome ולספות ברצף עם endosomes ו lysosomes, אשר מספקים את המנגנון המולקולרי הדרושים כדי acidify את efferosome וכדי לבזות את מוות תא המטען^13,14. ברגע מושפל, החומרים הנגזרות תא אפופטוטיים להיפגע הם הנסחר אנדוזום מיחזור – תהליך אשר מגביל את תגובות מערכת החיסון כדי מוות נגזר תא אנטיגנים, אשר עשוי לאפשר התאוששות של חומרים מזינים מוות תא^{13, 15}. כישלון efferocytosis תוצאות סיקול לקוי של מוות תאים; תאים אלה שלא סולק בסופו של דבר עוברים נמק משנית. תאים עם נמק לשחרר תוכן cytosolic פרו דלקתיים, פתוגנים, autoantigens לתוך חצרו חוץ-תאית, ובכך גרמה מגוון של מחלות זיהומיות, דלקתית אוטואימונית^16,17. יחד, אפופטוזיס ועל efferocytosis להקל על הסרת תאים מתים וכל מת וגם מאפשרים שמירה על הומאוסטזיס רקמות.

לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס efferocytosis דורש שיטות המספקים כימות ברורה של ספיגת תא אפופטוטיים להיפגע. כימות הזה, זה מורכב על ידי העובדה כי בניגוד אחרים ספיגת מנגנונים כגון אנדוציטוזה phagocytosis^18,19, efferocytosis לא עלולה היבלעות של תא היעד ללא פגע, והתוצאה היא תפיסה טיפין טיפין התא אפופטוטיים להיפגע על-ידי efferocyte²⁰. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מתאר של במבחנה efferocytosis assay המספק תיחום מדויק של למביטה לעומת הלא-הפנימו חלקים של תאים בודדים אפופטוטיים להיפגע, יכול להיות משולב עם מגוון תאים קבוע, גישות לחיות תאים במיקרוסקופ. מבחני phagocytosis מסורתי להוסיף נוגדנים ספציפיים אל היעד phagocytic בסוף הניסוי כדי לתייג לא הפנימו את המטרות, בעוד השיטה שלנו שונה בכך labelling המטרה אפופטוטיים להיפגע עם ביוטין מקושר covalently^{21 , 22}. בזמן מוות תא נוגדנים ספציפיים שיכולים לשמש זה וזמינותו, הגישה biotinylation מאפשר עבור כל מטרה חלבון מניבי להיות מתויגת, מונע בעיות אפשריות עם נוגדנים משניים אשיג אם immunostaining מתבצע . באופן ספציפי, אנחנו חלוקה לרמות את הכנת אפופטוטיים להיפגע Jurkat תאים שעברו שהוכתמו כפול עם צבע מעקב תא והן ביוטין. מעקב אחר לצבוע את התא מאפשר אפופטוטיים להיפגע חומרים נגזר התא להיות במעקב במהלך efferocytosis, ואילו biotinylation משטח מאפשר האפליה של הפנימו מחלקים שאינם הפנימו efferocytosed מוות תאים. אנו מתארים גם את התרבות והכנה של שורות תאים J774.2 ו- THP-1 עבור שימוש כמו efferocytes מאתר ואנושי, נגזר מונוציט מקרופאגים M2 כדוגמה efferocytosis התא הראשי ותאים Jurkat לשימוש כמטרות efferocytic. שיטות אלה ניתן להחיל בקלות שורות תאים או ראשי תאים, התאים היעד שעברו כל צורה של מוות תאי (אפופטוזיסלמשל , נמק, necroptosis), וכדי מחקה בגודל מיקרון שידמה מוות תאים דרך השומנים ציפויים אחרים או ציפוי עם ליגנדים ספיציפית הקולטן efferocytic עניין.

השיטה המתוארות ב פרוטוקול זה יש כמה יתרונות על פני שיטות cytometry מבוסס זרימה נפוץ^23,שדה²⁴. על ידי הדמיה ישירות את האינטראקציה תא פגוציט-מוות, בשילוב עם תיוג ברור של שני חומר תא הכולל והפנמתי הלא מוות, מדדים כמותיים של efferocytosis יכול להתבצע. יתר על כן, מגביל השימוש fluorophores pH-רגישות גורמים מבלבלים כגון הדיכוי של זריחה FITC ו- GFP ב- pH lysosomal שמבלבלת כמה שיטות אלטרנטיביות²⁵. לבסוף, בעוד לא תיאר בפירוט, שיטות אלה יכול להיות מועסק באמצעות efferocytes לבטא שכותרתו fluorescently transgenes, או עם קיבוע שאחרי immunostaining, כדי לאפשר על כימות של פעילות מולקולת איתות וניטור של תהליכים תאיים במהלך efferocytosis.