单细胞荧光显微镜定量 Efferocytosis 的研究

细胞凋亡, 或程序性细胞死亡, 是一种高度调控的生理过程, 发生在大多数多细胞有机体, 是关键的发展和稳态¹。细胞凋亡除了参与正常细胞更替和胚胎发育外, 还能消除组织中受感染或受损的细胞, 并可因感染、炎症、癌症以及医疗干预而触发。如放疗或类固醇¹。凋亡细胞在细胞表面暴露出 “吃-我” 信号, 在一系列专业和非专业吞噬中被受体识别, 统称为 “efferocytes”。这些受体的参与通过一个被称为 efferocytosis^2,3的过程诱导 efferocyte 凋亡细胞的吸收和降解。磷脂是最具特色的食我信号驱动 efferocytosis。它通常局限于血浆膜的内小叶, 凋亡激活一个脂质 scramblase, 扰乱这种膜不对称, 从而暴露磷脂在细胞表面⁴。磷脂是在一些非凋亡细胞的细胞外表面发现的, 如成熟巨细胞和活化血小板。然而, 这些细胞不是 efferocytosed 由于存在 “不吃我” 信号, 例如 CD47, 在他们的细胞表面^5,6,7。暴露的磷脂是由 efferocytes 表达的 efferocytic 受体阵列识别出来的。这些受体与磷脂的结合, 直接或通过 opsonins 的帮助, 激活信号通路, 促进吞没凋亡细胞成膜界的液泡称为 efferosome^8,9,10,11,12. efferosome 与内涵体和溶酶体依次融合, 提供酸化 efferosome 所需的分子机械, 并降解凋亡细胞^13、14。一旦降解, 凋亡细胞衍生材料被贩运到回收 endosome-一个过程, 限制免疫反应的凋亡细胞衍生抗原, 并可能允许从凋亡细胞¹³恢复养分^{, 15}。efferocytosis 的失败导致凋亡细胞的清除受损;这些未清除细胞最终会经历次生坏死。坏死细胞释放亲炎症胞浆的内容, 病原体和自身抗原进入细胞外环境, 从而驱动一系列感染, 炎症和自身免疫性疾病^16,17。同时, 细胞凋亡和 efferocytosis 促进了死亡和死亡细胞的清除, 并允许维持组织的稳态。

研究 efferocytosis 的分子机制需要方法, 提供一个明确的定量的凋亡细胞摄取。这种量化是复杂的事实, 不像其他吸收机制, 如吞和吞噬功能^18,19, efferocytosis 可能不会导致吞没完整的目标细胞, 导致零碎吸收凋亡细胞的 efferocyte²⁰。此处描述的协议描述了一种体外efferocytosis 分析, 它提供了对个体凋亡细胞内化和非内隐部分的精确划分, 并可与各种固定细胞和活细胞显微镜的方法。传统的吞噬功能检测在实验结束时添加特定于吞噬目标的抗体, 以标记非内化目标, 因为我们的方法不同于用共价键链接的生物素²¹标记凋亡目标。^,22. 虽然在本试验中可以使用凋亡细胞特异抗体, 但 biotinylation 方法允许任何含蛋白质的靶标记, 并避免在执行染色时具有继发抗体交叉反应性的潜在问题.具体地说, 我们概述了细胞追踪染料和生物素双重染色的凋亡 Jurkat 细胞的制备。细胞追踪染料允许在 efferocytosis 期间追踪凋亡的细胞源材料, 而表面 biotinylation 则允许从 efferocytosed 凋亡细胞的非内化部分中内隐化。我们还描述了 J774.2 和 THP-1 细胞系的培养和制备, 用作小鼠和人的 efferocytes, 单核细胞衍生的 M2 巨噬细胞作为原电池 efferocytosis 的例子, Jurkat 细胞用作 efferocytic 靶。这些方法可以很容易地应用到其他细胞系或主细胞, 目标细胞发生任何形式的细胞死亡 (如凋亡, 坏死和 necroptosis), 以及微米大小模仿, 通过脂质涂层模拟凋亡细胞或efferocytic 受体所特有的配体涂层。

本协议中概述的方法比基于流式细胞术的方法在^23、24领域中的应用有若干优点。通过对吞噬凋亡细胞相互作用的直接成像, 结合对全内和非内化凋亡细胞材料的清晰标记, 可进行 efferocytosis 定量测量。此外, 使用 pH 不敏感的显影限制混淆因素, 如抑制 FITC 和 GFP 荧光在溶酶酶的 pH 值混淆一些替代方法²⁵。最后, 虽然没有详细描述, 这些方法可以使用 efferocytes 表达荧光标记转基因, 或与后固定染色, 以允许量化的信号分子活动和监测efferocytosis 过程中的细胞过程。