Ett protokoll för att utvärdera antigen-specifika T-cell svar i immunoprivileged organ Ifnar1– / – murina modellen för Zika virus (ZIKV) infektionen beskrivs. Denna metod är avgörande för att utreda de cellulära mekanismerna för skydd och immunpatogenes ZIKV vacciner och är också värdefull för deras effekt utvärdering.
Zikaviruset (ZIKV) kan framkalla inflammation i immunoprivileged organ (t.ex., hjärnan och testiklarna), leder till Guillain-Barrés syndrom och skada testiklarna. Under en infektion med ZIKV, har immunceller visat att infiltrera i vävnaderna. De cellulära mekanismer som definierar den skydd eller immunpatogenes av dessa immunceller under en ZIKV infektion är dock fortfarande till stor del okända. Häri, beskriver vi metoder för att utvärdera funktionen virus-specifika T-celler i dessa immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss. Dessa metoder inkluderar en) en ZIKV infektion och vaccin-inympningen i Ifnar1– / – möss; (b) histopatologi, immunofluorescens och immunohistokemi analyser att upptäcka virusinfektion och inflammation i hjärnan, testiklarna och mjälte; (c) utarbetande av en tetramer av ZIKV-derived T-cell epitoper; (d) detektion av ZIKV-specifika T-celler i de monocyter som isolerats från hjärnan, testiklarna och mjälte. Med dessa metoder, är det möjligt att upptäcka de antigen-specifika T-celler som har infiltrerat i immunoprivileged organ och utvärdera funktionerna av dessa T-celler under infektionen: potentiella immun skydd via virus clearance och / eller immunpatogenes förvärra inflammationen. Dessa fynd kan också hjälpa för att klargöra bidrag av T-celler som induceras av immunisering mot ZIKV.
ZIKV är en moskitburen flavivirus som isolerades första gången 1947 i Uganda från en febril rhesus makaker. Nyligen, ZIKV har blivit en folkhälsa nödsituation, på grund av dess snabba spridning i Amerika och dess oväntade koppling till mikrocefali och Guillain-Barrés syndrom1,2,3. Från epidemiologiska data, har ZIKV misstänkts vara orsaken av Guillain-Barrés syndrom i omkring 1 per 4 000 smittade vuxna4. Dessutom har en korrelation mellan ZIKV och testiklarna infektion/skadan i musmodell påvisats, tyder på att ZIKV smitta, under vissa omständigheter kan kringgå den blod-testis-barriären och så småningom leda till manlig infertilitet5 . Dessa fynd belysa vikten av att helt förstå induktion av skyddande eller patologisk immunsvar under en ZIKV infektion.
Mycket återstår läras om cellulära immunsvaret till ZIKV. CD4+ och CD8+ T-cell svar till kapsid, kuvert och ickestrukturella protein 1 (NS1) har observerats hos ZIKV-infekterade apor och människor6,7,8. Hos möss, flera studier har visat att CD8+ T celler spelar en skyddande roll i kontrollen av ZIKV replikering9,10,11. Ännu viktigare, Jurado et al. visade att en ZIKV infektion resulterar i nedbrytning av den blod – hjärnbarriären och perivaskulär infiltration av CD8+ effektor T-celler i testiklarna av Ifnar1– / – möss. Dessutom visade de att CD8+ T celler inleda ZIKV-associerade förlamning och verkar spela en roll i den neonatala hjärnan immunopathology. I en tidigare studie har vi förberett de ZIKV-E294-302 tetramer och visade att ZIKV-specifika CD8+ T celler finns i hjärna och ryggmärg ZIKV-infekterade Ifnar1– / – möss, som kan ha stor betydelse för utformningen och utveckling av ZIKV vacciner10.
Svar på brådskande behovet av vaccination att förhindra ZIKV infektioner, är flera vacciner i de prekliniska utvecklingsfaserna, inklusive RNA vacciner, rekombinant vektor-baserade vacciner och renat protein subenhet vacciner. Plasmid DNA vaccinet är i fas 1 kliniska prövningar12. Utvärderingen av säkerhet och effekt för ZIKV vacciner är därför viktig. En fördel med vacciner är deras förmåga att framkalla specifika T-cell svar, som kan vara viktiga för skydd mot ZIKV. Genom att använda ZIKV-derived T-cells epitop-relaterade tetramers, den T-cell immunoreaktivitet induceras av ett adenovirus-vektor-baserade ZIKV vaccin kunde detekteras i immuniserade mössen, och både M och E glykoproteiner visades att inducera robust antigen-specifika CD8+ T-cell immunoreaktivitet13.
Under en virusinfektion är erkännandet av peptid antigener presenteras av stora histocompatibility komplex (MHC) molekyler till T-cells receptor (TCR) en viktig T-cell-medierad mekanism för att skydda den värd14. Utifrån denna teori, är tetramer teknik ett unikt verktyg för att belysa de roller som antigen-specifika T-celler spelar i reglering av immunsvar15. Det här protokollet beskriver upprättandet av Ifnar1– / – musmodell för ZIKV infektioner, och upptäckt av reaktiva T-celler i mjälte, hjärna och testiklarna hos möss genom att använda tetramer teknik. Dessutom använde vi den ZIKV-E294-302 tetramer att identifiera och utvärdera T-cell immunoreaktivitet inducerad av ZIKV vaccin (AdC7-M/E) i immuniserade mössen. Denna studie ger vägledning för att utreda T-cell svar i immunoprivileged organ och ger en referens för de potentiella tillämpningar i moderkakan eller fostrets hjärna.
Immunogent T-cells epitop spelar en betydande roll i cellulär immunitet mot patogener23. Påvisande av ZIKV-specifika T-celler i immunoprivileged organ är alltså en kritisk metod att förstå T-cell svar mot den naturliga ZIKV-infektionen. Under tiden är T-cell svar upptäckt ett utmärkt verktyg för att undersöka effekten av den virala vaccin. Här visar vi ett omfattande protokoll att visualisera de experiment, som inkluderar isolering av lymfocyter från mjälte, hjärna och testiklarna hos ZIKV-infekterade möss, utarbetandet av den immundominant epitop E294-302 tetramer, och den erkännande av ZIKV-specifika CD8+ T celler i immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss.
En tidigare studie visade att en levande ZIKV eller dess RNA kan påvisas i sperma från manliga patienter, vilket indikerar att ZIKV kan kringgå den blod-testis-barriären och replikera sig själv i det reproduktiva system24. Tidigare visade vi också att ZIKV kan skada testiklarna och leda till manlig infertilitet i möss25. ZIKV infektion kan leda till viremi hos rhesusapor och den virus-RNA kan påvisas i det centrala nervsystemet (CNS), liksom i de viscerala organ. Immunohistokemi avslöjade att ZIKV-specifika antigener presenterades i CNS och flera perifera organ26. Också, i murina modeller, ZIKV infektion kan inducera en robust antivirala CD8+ T-cellssvar i mjälte och CNS26.
Denna studie jämfört med tidigare arbete, och upprättar systematiska metoder för att upptäcka ZIKV-specifika CD8+ T-cell svar i hjärnan och testiklarna, som är immunoprivileged platser. Det är viktigt att utvärdera funktionaliteten i virus-specifika T-celler i immunoprivileged organ ZIKV-infekterade möss. Användningen av tetramers att upptäcka ZIKV-specifika CD8+ T-cell svar i immunoprivileged organ skulle kraftigt öka vår förståelse av ZIKV infektioner och deras värd immunsvar. Använda E294-302 tetramer, kan virus-specifika T-celler i hjärnan och testiklarna vara isolerat av flödescytometri, för att undersöka de cellulära mekanismerna för skydd och immunpatogenes under en ZIKV infektion. Samtidigt är det bra för forskare att undersöka ytterligare funktioner i CD8+ T celler att styra ZIKV, eller för att förbättra immunpatogenes i dessa organ under ZIKV infektion.
Att analysera de antigen-specifika murina CD8+ T-cell svar i immunoprivileged organ, vi förberedda H-2Db-E294-302 tetramer och upptäckt CD8+ T celler av flödescytometri. Tetramers är ett kraftfullt verktyg att upptäcka antigen-specifika T-celler. Här, genererades tre typer av fluorokrom-konjugerad streptividin (APC, PE, och BV421). Även om det finns inga statistiskt signifikanta skillnader i APC-, BV421- och PE-märkt tetramers för påvisande av antigen-specifika T-celler, PE-märkt pMHC-jag tetramers gav bästa resultat. Därför användes den PE-märkt tetramer under hela studien. Intressant, upptäckt baserat på den PE-märkt H-2Db-E294-302 tetramer, vi höga nyckeltal av antigen-specifika T-celler i både hjärnan och testiklarna, som indikerar de virus-specifika T-cellerna från blodet att migration förmåga immunoprivileged organ.
Det finns dock vissa begränsningar i protokollet. Den H-2Db-E294-302 tetramer är inte användbart för humant T-cell upptäckt, eftersom tetramer upptäckt är beroende av MHC begränsning. Screening av immundominant HLA-begränsad peptider krävs fortfarande. Förutom, retro-orbital infektion är effektiv för en ZIKV infektion men kan inte vara en bekväm manövrering för vissa utredare. Således, andra vägar på infektion, inklusive peritonealdialys, subkutan eller intravenös, rekommenderas också.
I protokollet som beskrivs här, är ett avgörande steg isoleringen av monocyter från hjärnan och testiklarna. Det är viktigt att förvärva hög kvalitet lymfocyter; Det är därför viktigt att uppmärksamma, exempelvis centrifugal hastigheten, styrkan av slipning vävnad och dissektion av hjärnan och testiklarna vävnaden. Dessutom för tetramer förberedelse är proteashämmare (PMSF, pepstatin, leupeptin) användbara när du skyddar ett protein från att degraderas. Därför är det vettigt att lägga till en proteashämmare refolding bufferten och byta bufferten under processen av tetramer preparatet.
Avslutningsvis presenterar vi metoder för att påvisa antigen-specifika T-cell svar i immunoprivileged organ Ifnar1– / – musmodell för en ZIKV infektion. Denna plattform kan i stor utsträckning för att undersöka de immunologiska mekanismerna framväxande och åter framväxande virus som kan kringgå hindren mellan blodet och de immunoprivileged organen. Dessutom kan denna studie bana väg för den framtida utvecklingen av kandidat vaccin och immunterapier.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Gary Wong för den engelska revision. Detta arbete var stöds av nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (grant 2017YFC1200202), den större särskilda projekt för infektiös sjukdom forskning i Kina (grant 2016ZX10004222-003). George F. Gao är en ledande projektledare i nationella naturvetenskap Foundation av Kina innovativa forskargruppen (grant 81621091).
Z6 | our lab | Ma W, Li S, Ma S, et al. Zika virus causes testis damage and leads to male infertility in mice. Cell, 2016, 167: 1511-1524 e1510 | |
CD3 | Santa Cruz | sc-1127; RRID: AB_631128 | |
Fluorescein-Conjuated Affinipure Goat anti-human IgG(H+L) | ZSGB-BIO | ZF-0308 | |
Rabbit Anti-Goat IgG, FITC Conjugated | CWBIO | CW0115 | |
FITC anti-mouse CD3 | Biolegend | 17A2 | |
APC anti-mouse CD3 | Biolegend | 100236 | |
PerCP anti-mouse CD8a | Biolegend | 100732 | |
Percoll | GE Healthcare | P8370 | |
PMSF | Ameresco | 0754-5G | Toxic and corrosive reagent. Handle with care |
Streptadivin | BD | S4762-FZ | Gives a clear solution at 10mg/ml in PBS and stored at -20 °C |
Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | 5 mg in 2.5 ml DMSO, aliquots stored at -20ºC |
Leupeptin | Sigma | L8511 | 5 mg in 2.5 ml dH 2 O, aliquots stored at – 20ºC |
Peptides | Scilight-peptide | Must be resuspended in DMSO and stored at -20 °C | |
RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | Must be stored at 4°C |
DMSO | MP | 219605590 | Store at room temperature. |
APC-Streptadivin | BD | 554067 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
FITC-Streptadivin | BD | 554060 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PE-Streptadivin | BD | 554061 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
BV421-Streptadivin | BD | 563259 | Must be stored and maintained at 4°C. Do not freeze. |
PageRuler Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Must be stored at 4°C |
Cell Strainers | BF | BF10-5040 | Store at room temperature. |
Amicon Ultra 100kDa | Millipore | UFC510024 | Store at room temperature. |
Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
FACS Cantol | Flow cytometer must contain lasers and filters that are compatible with the staining panel used. | ||
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE healthcare | 28990944 | |
AKTA PURE | GE healthcare | ||
red blood cell lysis buffer | Solarbio | R1010 | Store at 4°C. |