Funktionell karakterisering av Carboxylesterases i insektsmedel resistenta hus flugor, Musca Domestica

Insektsmedel motstånd är för närvarande en huvudfråga hus flugkontroll världsomspännande^1,2. Ansträngningar för att fastställa mekanismen av insektsmedel motstånd underlättar bättre förståelse av problemet och ger därmed nya strategier för att effektivt förhindra eller minimera spridning av resistens utveckling³. Carboxylesterases, har som en av de stora avgiftning enzymerna, lockat en hel del uppmärksamhet för sina roller i komplexbildare och metaboliserar insekticider i olika insekter^4,5,6. Vår tidigare studie har identifierat flera carboxylesterases i hus flugor och deras uttryck nivåer var inte bara konstitutivt uppreglerat i den resistent ALHF stammen men kan också induceras till högre nivåer som svar på permetrin behandlingar⁷ . De funktionella karakteriseringar av dessa karboxylesteras gener i metaboliserande insekticider återstår dock undersökas.

Sedan den första rapporten i början av 1980-talet⁸, har en baculoviridae-medierad utländska gen uttryck system varit allmänt anställd på grund av dess höga protein produktionseffektivitet och eukaryota protein bearbetning kapacitet⁹. Denna binära systemet består av två grundläggande element: den konstruerade rekombinant baculoviridae att leverera främmande gener i värdcellerna och storskaliga uttrycket av intresserade av proteiner av celler som smittats av rekombinant baculoviridae. Under de senaste decennierna, baculoviridae medierad cell uttryck systemet har använts i stor utsträckning att producera tusentals rekombinanta proteiner, alltifrån cytosoliska enzymerna till membran-bundna proteiner i insekt och däggdjurs celler¹⁰. Vår tidigare studie har framgångsrikt uttryckte flera CYP450-enzymer i insekt Sf9 celler med detta system¹¹. I denna studie vi konstruerade en karboxylesteras-rekombinant baculoviridae för att infektera insekt Sf9 celler, utforskade den cell toleransen mot olika permetrin behandlingar och storskaliga uttryckt karboxylesteras proteiner i vitro för funktionell utforskning. Istället för att undersöka flera karboxylesteras isozymet blandningar från insekt homogenates antagits av tidigare studier^12,13, detta baculoviridae-medierad insekt cell uttryck systemet tillåter det specifika uttrycket och isolering av riktade proteiner för bättre karaktärisering av deras biokemiska och strukturella egenskaper.

Tetrazolium saltbaserade analysen (MTT) är en hög genomströmning kolorimetrisk metod utvecklad och optimerad för att mäta cellviabilitet. Denna analys bygger på den mekanism som endast levande celler kan av metaboliserande gul-färgade MTT reagens till en mörk lila färgade formazan fällning, som kan analyseras kolorimetriskt efter upplöst i organiska lösningsmedel^{14, 15}. Flera mer exakt, men tidskrävande metoder, såsom Trypan blå utslagning och tymidin titrering assay^16,17, har utvecklats under de senaste åren. Cellbaserade MTT analysen redovisas dock fortfarande närvarande som den mest snabb och lättmanövrerad metoden att snabbt upptäcka cellviabilitet. Här, använder vi MTT analysen för att utforska cell toleransen mot insektsmedel behandlingar. Förbättrad tolerans av celler när infekterade med karboxylesteras rekombinant baculoviridae starkt stöder carboxylesterases till insekticider, vilket i sin tur tyder på deras engagemang i insektsmedel motstånd metabola roller.

Dessutom genomfördes ett in vitro- metabola test också i denna studie. Jämfört med allmänna karboxylesteras analyser som använder vanliga substrat såsom α-napthyl acetat (α-NA) och β-naftyl acetat (β-NA) för att återspegla hydrolytiska verksamhet av carboxylesterases, betraktas in vitro- metabola studien som ett korrekt sätt att direkt mäta aktiviteter av carboxylesterases mot insekticider¹⁸. Denna metod har använts framgångsrikt i olika insekter att karakterisera flera cytokrom P450s i samband med insektsmedel motstånd^11,19,20. Men har denna metod ännu inte tillämpats i karboxylesteras studier. Med tillgängligheten av karboxylesteras proteiner som produceras av baculoviridae-medierade uttryck systemet, kan vi utföra en in vitro- metabola studie av carboxylesterases mot permetrin, vilket ytterligare kan ge starka bevis för inblandning av carboxylesterases i ger pyretroidbaserade resistens i hus flyger.