Функциональная характеристика Carboxylesterases в стойкие инсектициды дома мух, Муха Domestica

Резистентность к инсектицидам в настоящее время является серьезной проблемой дом летать контроль во всем мире^1,2. Попытки определить механизм инсектицидам способствует лучшему пониманию этого вопроса и таким образом обеспечивают Роман стратегии эффективно предотвратить или свести к минимуму Распространение сопротивления развития³. Carboxylesterases, как один из основных детоксикации ферментов, привлекли много внимания из-за их роли в поглощения и метаболизма инсектицидов в различных насекомых^4,5,6. Наши предыдущие исследования выявил несколько carboxylesterases в доме мух и их уровни выражения были не только конститутивно вверх регулируются резистентными штаммами ALHF, но также может быть индуцированных для более высоких уровнях в ответ на перметрин лечения⁷ . Однако функциональные характеристики этих carboxylesterase генов в метаболизм инсектицидов по-прежнему быть изучены.

После представления первого доклада в начале 1980-х⁸бакуловирусы опосредованной иностранных ген выражение системы широко используются из-за его эффективности производства высоким содержанием белка и эукариотических белка, обработки возможностей⁹. Эта двойная система состоит из двух основных элементов: сконструированный рекомбинантных бакуловирусы доставки чужеродных генов в клетки хозяина и крупномасштабных выражение заинтересованных белков в клетках, инфицированных рекомбинантного бакуловирусы. За последние десятилетия бакуловирусы опосредованной клеток выражение системы широко используется производить тысячи рекомбинантных белков, начиная от цитозольной ферментов с белками мембраны прыгните насекомых и млекопитающих клеток¹⁰. Наши предыдущие исследования успешно выразил несколько CYP450 ферментов насекомых Sf9 клетки с этой системы¹¹. В этом исследовании, мы построен carboxylesterase рекомбинантных бакуловирусы заразить клетки насекомого Sf9, изучаются терпимости клеток для лечения различных перметрин и крупномасштабных выраженной carboxylesterase белков в пробирке для функциональных разведки. Вместо того, чтобы расследование нескольких carboxylesterase изоферменты смеси от насекомых гомогенатах, принятый ранее исследования^12,13, эта система выражение бакуловирусы опосредованной насекомых клеток позволяет конкретное выражение и изоляция целевых белков для лучшего изучения их биохимических и структурных свойств.

Пробу на основе соли tetrazolium (МТТ) является высок объём колориметрическим методом разработаны и оптимизированы для измерения жизнеспособности клеток. Этот assay основан на механизме, который только живые клетки способны метаболизировать реагент МТТ желтый цвет к темный фиолетовый Цветные Формазаны осадок, который может быть проанализирован нелабильном после того, как растворяется в органических растворителях^{14, 15}. Несколько более точным, но много времени методы, такие как Трипановый синий изоляции и тимидина титрования пробирного^16,17, были разработаны в последние годы. Однако на основе клеток МТТ пробирного до сих пор в настоящее время признается как метод наиболее быстрым и легко управлять быстро обнаружить жизнеспособность клеток. Здесь мы используем МТТ assay для изучения клеток терпимость против инсектицидами лечения. Повышение толерантности клеток когда инфицированных рекомбинантного бакуловирусы carboxylesterase решительно поддерживает метаболические функции carboxylesterases чтобы инсектициды, которые в свою очередь предполагает их участие в инсектицидам.

Кроме того в пробирке метаболических assay также было проведено в этом исследовании. По сравнению с общим carboxylesterase анализов, которые используют общие субстратов, например α-napthyl ацетат (α-NA) и β-naphthyl ацетат (β-NA) для отражения гидролитическая деятельности carboxylesterases, исследование метаболизма в vitro рассматривается как точный способ для прямого измерения деятельности carboxylesterases к инсектицидам¹⁸. Этот метод успешно работает в различных насекомых характеризовать множественные цитохрома P450s совместно с инсектицидами сопротивление^11,19,20. Однако этот метод еще не применяется в carboxylesterase исследованиях. При наличии carboxylesterase белков, производимые бакуловирусы опосредованной выражение системы мы можем выполнить в vitro метаболических исследование carboxylesterases сторону перметрин, который далее может предоставить убедительные доказательства участия из carboxylesterases в присвоении пиретроид сопротивления в доме мух.