Funksjonell karakteristikk av Carboxylesterases i insektmiddel resistente hus fluer, Musca Domestica

Insektmiddel motstand er et stort problem av huset fly kontroll over hele verden^1,2. Å bestemme mekanismen av insektmiddel motstand muliggjør bedre forståelse av dette problemet, og dermed gi romanen strategier for å effektivt forhindre eller redusere spredningen av resistens utvikling³. Carboxylesterases, som en av de viktigste avgiftning enzymene, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet for sine roller i sequestering og metabolizing insektmidler i ulike insekter^4,5,6. Våre tidligere studier har identifisert flere carboxylesterases i huset fluer og uttrykk nivåene var ikke bare constitutively opp-regulert i motstandsdyktig ALHF belastningen, men også kan bli overtalt til høyere nivåer svar permethrin behandlingene⁷ . Men gjenstår de funksjonell karakteristikkene av disse carboxylesterase gener i metabolizing insektmidler å bli utforsket.

Siden den første rapporten i tidlig 1980-tallet⁸, har en baculovirus-mediert utenlandske gene expression system vært viden ansatt på grunn av sin høye protein effektivitet og eukaryotic protein behandling evner⁹. Denne binært system består av to grunnleggende elementer: den konstruert rekombinant baculovirus levere utenlandsk gener i verten cellene, og den store uttrykket for interessert proteiner av celler som er infisert av rekombinant baculovirus. De siste tiårene, baculovirus mediert cellen uttrykk systemet har vært mye brukt til å produsere tusenvis av rekombinante proteiner, alt fra cytosolic enzymer membran-bundet proteiner i insekt og pattedyr cellene¹⁰. Vår forrige studie uttrykt ble flere CYP450 enzymer i insekt Sf9 celler med dette systemet¹¹. I denne studien vi bygget en carboxylesterase-rekombinant baculovirus å infisere insekt Sf9 celler, utforsket celle toleransen til forskjellige permethrin behandlingene og store uttrykt carboxylesterase proteiner i vitro for funksjonell leting. I stedet for undersøke flere carboxylesterase isozyme blandinger fra insekt homogenates som ble vedtatt av tidligere studier^12,13, baculovirus-mediert insekt celle uttrykk systemet lar bestemt uttrykket og isolering av målrettet proteiner for bedre karakteristikk av biokjemiske og strukturelle egenskapene.

Tetrazolium salt-baserte analysen (MTT) er en høy gjennomstrømming kolorimetrisk metode utviklet og optimalisert for å måle celle levedyktighet. Denne analysen er basert på mekanismen som bare levende celler kan metabolizing gul-farget MTT reagensen til en mørk lilla farget formazan bunnfall, som kan analyseres colorimetrically etter oppløst i organiske løsemidler^{14, 15}. Flere mer nøyaktig, men tidkrevende metoder, for eksempel Trypan blå eksklusjon og de thymidine titrering analyse^16,17, har blitt utviklet i de senere år. Imidlertid er cellebasert MTT analysen fortsatt anerkjent som den mest rask og lett å bruke metoden å raskt oppdage celle levedyktighet. Her bruker vi MTT analysen for å utforske celle toleransen mot insektmiddel behandlinger. Forbedret toleranse av celler når infisert med carboxylesterase rekombinant baculovirus sterkt støtter metabolske rollene som carboxylesterases til insektmidler som igjen antyder deres engasjement i insektmiddel motstand.

I tillegg ble i vitro metabolske analysen gjennomført i denne studien. Sammenlignet med generelle carboxylesterase analyser som bruker vanlige underlag som α-napthyl acetate (α-NA) og β-naphthyl acetate (β-NA) for å reflektere hydrolytisk aktivitetene til carboxylesterases, regnes i vitro metabolske studien som en nøyaktig måte mål av carboxylesterases mot insektmidler¹⁸direkte. Denne metoden har vært vellykket ansatt i ulike insekter som karakteriserer flere cytochrome P450s i samarbeid med insektmiddel motstand^11,19,20. Men har denne metoden ikke ennå blitt brukt i carboxylesterase studier. Med anvendeligheten av carboxylesterase proteiner produsert av baculovirus-mediert uttrykk systemet, kan vi utføre en i vitro metabolske studie av carboxylesterases mot permethrin, som kan videre gir sterke bevis på engasjement av carboxylesterases i overdragelse pyrethroid motstand i huset flyr.