In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (T_HGM)

Células de CD4 + T auxiliar (T_H) são componentes essenciais do sistema imunológico, tendo papéis cruciais na defesa do hospedeiro contra patógenos microbianos, na vigilância do câncer e em auto-imunidade^1,2,3. Após a ativação do receptor (TCR) de células T, células T CD4 + de ingênuo podem ser diferenciadas em T_H1, T_H2, T_H 17, ou regulamentar T (Treg) as células sob a influência de diferentes citocinas www.UniEthos.org.br^{2,4, 5}. recentemente, um novo subconjunto de células T_H , que produz predominantemente GM-CSF, foi identificado e nomeado T_HGM⁶. A diferenciação de células T_HGM é impulsionada por IL-7 através da ativação de um transdutor de sinal e um ativador de transcrição 5 (STAT5). Estas células expressam uma grande quantidade de GM-CSF, tendo uma baixa expressão de outros T_H-célula assinatura citocinas como relato e IL-17⁶. GM-CSF, verificou-se a desempenhar um papel crítico no desenvolvimento de CD4 + neuroinflammation mediada por células T^7,8. Comparado ao relato – ou IL-17-expressando as células auto-reativas T, GM-CSF-expressando T células transferidos para o selvagem-tipo ratos (WT), causados um início de doença anterior e a maior severidade da doença. Além disso, as células T Csf2– / – não conseguiram induzir encefalomielite auto-imune experimental (EAE) depois enviaram transferidos para destinatários WT, Considerando que células T falta de relato ou IL-17A reteve a capacidade de mediar EAE⁷. Além disso, um bloqueio de GM-CSF, usando anticorpos neutralizantes amenizada EAE doença gravidade⁸. Além disso, uma deficiência de STAT5 em células T em camundongos resultou em uma geração T_HGM diminuída e, portanto, em uma resistência dos ratos a EAE desenvolvimento⁶. Estes resultados ressaltam a importância das células T GM-CSF-expressando_H na doença auto-imune MPTP. Assim, estabelecer um método para diferenciar as células T GM-CSF-expressando_H de células T CD4 + de ingênuo seria importante no estudo da patogênese de neuroinflammation auto-imune e respostas de imune mediada por células T. No entanto, um protocolo que eficientemente gera células T_HGM de murino naïve que CD4 + não foi estabelecida.

Aqui nós apresentamos um método que diferencia murino células T_HGM de células T CD4 + de ingênuo. Este protocolo descreve todo o processo, incluindo a extração do baço do mouse, a preparação de uma suspensão de célula única, a seleção positiva de CD4, a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e a célula T_H análise e diferenciação. As T auxiliar células diferenciadas são analisadas por citocinas intracelulares mancha combinada com citometria de fluxo para determinar a expressão de citocinas, a nível de célula única, por um PCR quantitativo em tempo real para determinar a expressão de citocinas no nível de mRNA, e por ELISA para avaliar a expressão de citocinas no nível de proteína. Esse método pode ser aplicado aos estudos de biologia de célula T_HGM sob várias condições, tais como a EAE, onde o GM-CSF desempenha um papel importante na patogênese.