In Vitro Différenciation des souris Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-production de cellules T auxiliaires (T_HGM)

Cellules CD4 + T auxiliaires (T_H) sont des éléments essentiels du système immunitaire, ayant un rôle crucial dans la défense de l’hôte contre les agents pathogènes microbiens, dans la surveillance du cancer et l’auto-immunité^1,2,3. Lors de l’activation de récepteur (TCR) de lymphocytes T, cellules T CD4 naïves peuvent être différenciés en T_H1, T_H2, T_H 17, ou réglementaires T (Treg) cellules sous l’influence de cytokines différents milieux^{2,4, 5}. récemment, un sous-ensemble de nouveau des cellules T_H , qui produit principalement des GM-CSF, a été identifié et nommé T_HGM⁶. La différenciation des cellules T_HGM est entraînée par l’IL-7 par le biais de l’activation d’un transducteur de signal et un activateur de transcription 5 (STAT5). Ces cellules expriment une grande quantité de GM-CSF tout en ayant une faible expression des autres T_H-cell signature cytokines telles que l’IFNγ et IL-17⁶. GM-CSF s’est avéré jouent un rôle essentiel dans le développement de CD4 + T cell-mediated neuroinflammation^7,,⁸. Par rapport à IFNγ ou IL-17-exprimant des cellules autoréactives T, T exprimant le GM-CSF cellules transférés à sauvage souris (WT) faits une apparition précoce de la maladie et la gravité de la maladie. En outre, les cellules de T de Csf2– / – n’a pu induire encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) après avoir été transféré Moutschen aux destinataires WT, tandis que les cellules T dépourvues d’IFNγ ou IL-17 a conservé la capacité de provoquer des EAE⁷. En outre, un blocus de GM-CSF à l’aide d’anticorps neutralisants amélioré EAE maladie gravité⁸. En outre, une carence de STAT5 dans les cellules T chez les souris a entraîné dans une génération T_HGM diminuée et, partant, à une résistance des souris EAE développement⁶. Ces résultats soulignent l’importance des lymphocytes T exprimant le GM-CSF_H de maladie auto-immune thérapeutiques. Ainsi, en établissant une méthode pour différencier les cellules T exprimant le GM-CSF_H de cellules T CD4 + naïve serait important dans l’étude de la pathogenèse de la neuro-inflammation auto-immune et immunité à médiation cellulaire T. Toutefois, un protocole qui efficacement génère des cellules T_HGM de murin naïf que CD4 + n’a pas été établi.

Nous présentons ici une méthode qui se différencie des cellules T_HGM de cellules T CD4 naïves. Ce protocole décrit l’ensemble de la procédure, y compris l’extraction de la rate de la souris, la préparation d’une suspension de cellules individuelles, la sélection positive de CD4, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et la cellule T_H différenciation et l’analyse. Lymphocytes T helper différenciés sont analysés par cytokine intracellulaire coloration combinée avec écoulement cytometry pour déterminer l’expression de cytokines au niveau unicellulaire, par une PCR quantitative en temps réel afin de déterminer l’expression de cytokines au niveau de l’ARNm, et par ELISA pour évaluer l’expression de cytokines au niveau de la protéine. Cette méthode peut être appliquée aux études de biologie cellulaire T_HGM dans diverses conditions, telles que EAE, où GM-CSF joue un rôle important dans la pathogenèse.