Her beskriver vi en protokoll som er tilpasningsdyktige, hele vert, høyt innhold screeningsverktøy som kan brukes til å studere vert-patogen interaksjoner og brukes for medisiner.
Antall nye stoffer identifisert av tradisjonelle i vitro skjermer har svekket, redusere suksessen til denne tilnærmingen i letingen etter nye våpen mot flere resistens. Dette har ført til konklusjonen at forskerne ikke trenger bare å finne nye stoffer, men må også utvikle nye måter å finne dem. Blant de mest lovende kandidaten metoder er hele-organisme, i vivo søk at bruk høy gjennomstrømning og fenotypiske readouts og vert som spenner fra Caenorhabditis elegans til Danio rerio. Disse vertene har flere kraftige fordeler, inkludert dramatiske reduksjoner i falske positive treff, som forbindelser som er giftige for vert og/eller biounavailable utelates vanligvis første skjermen før kostbare følge opp.
Her viser vi hvordan våre analysen er brukt til å forhøre vert variasjon i den godt dokumentert C. elegans,Pseudomonas aeruginosa flytende drap pathosystem. Vi viser også flere utvidelser av denne godt jobbet ut teknikken. For eksempel kan vi utføre høy gjennomstrømming genetisk skjermer bruker RNAi i 24 – eller 96-brønnen plate formater spørringen vert faktorer i denne verten-patogen samhandlingen. Bruker denne analysen, kan hele genomet skjermer gjennomføres på bare noen få måneder, som kan dramatisk forenkler oppgaven med å identifisere narkotika mål, potensielt uten behov for arbeidskrevende biokjemiske rensing tilnærminger.
Vi rapporterer også her en variant av vår metode som erstatter gram-positive bakterien Enterococcus faecalis for gram-negative patogen P. aeruginosa. Mye som er tilfellet for P. aeruginosa, er drepe av E. faecalis tidsavhengige. I motsetning til tidligere C. elegans–E. faecalis analyser, analysen vår E. faecalis ikke krever preinfection, forbedre sin sikkerhet profil og redusere sjansene for forurensende væske-håndtering av utstyr. Analysen er svært robust, viser ~ 95% dødelighet 96 h innlegget infeksjon.
Identifisering og utviklingen av effektive, bredspektret antibiotika, nå nesten et århundre siden, førte til et vannskille øyeblikk i folkehelsen der det var en utbredt tro at smittsomme sykdommer ville være en svøpe fortiden. I noen få korte tiår begynte optimismen å avta, som patogen etter patogen utviklet resistens som begrenset disse en gang mirakuløse behandlinger. For noen tid syntes våpenkappløp mellom drug discovery innsats og patogener balansert. Men har misbruk av poesi aksent nylig kulminerte i fremveksten av pan-resistente stammer av Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescensog P. aeruginosa1, 2,3,4.
P. aeruginosa er en opportunistisk, gram negativ, multi-Host patogen som er en alvorlig trussel for pasienter med alvorlige forbrenninger, som er nedsatt immunforsvar, eller har cystisk fibrose. Det er også stadig identifisert som en utløsende agent i alvorlig nosokomiale infeksjoner, spesielt på grunn av pågående oppkjøpet av resistensutvikling. For å begynne å ta denne trusselen, har vi brukt den veldokumenterte C. elegans–P. aeruginosa infeksjon system5. Våre lab har utnyttet dette systemet for å utvikle en vannbasert, høy gjennomstrømning og høyt innhold screening plattform for å identifisere romanen forbindelser som begrenser patogen å drepe vert6. Intriguingly, synes disse forbindelsene å tilhøre minst tre generelle kategorier, inkludert poesi aksent7 og virulens hemmere8. Andre høyt innhold drug discovery analyser i C. elegans er rapportert for Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, blodlegemer, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, og Enterococcus faecalis, blant annet9,10,11,12,13,14,15,16. Disse typer analyser har flere anerkjente fordeler, for eksempel begrense falske positive treff som kan være giftig for både verten og patogen, økt sannsynlighet for biotilgjengelighet sammenlignet med en kjemisk skjerm, og evnen til å identifisere treff utover bare begrense mikrobiell vekst, som anti-virulents, immun stimulerende molekyler eller forbindelser som ellers vipper vert-patogen samhandlingen for den tidligere balansen. I tillegg er forbindelser i disse skjermene ofte effektive i pattedyr verter.
Det er verdt å merke seg at minst to andre analyser17,18 er tilgjengelig til å utføre høy gjennomstrømming skjermer i C. elegans i væske. Hver av disse analyser er imidlertid en endring som lar prototypiske intestinal kolonisering analysen, kjent som sakte-drapet, utføres i væske, øke gjennomstrømming og gir forbindelser til screenes lettere. Forsiktig karakterisering har definitivt vist at mekanismer for bakteriell virulens er forskjellige mellom disse analyser og våre vannbasert skjermen7. Siden begge typer virulens er observert i pattedyr systemer, er det viktig å vurdere hvilke virulens determinant er mest relevante for den eksperimentator interesser før analysen valget.
Her viser vi en optimalisert versjon av den vannbasert C. elegans-P. aeruginosa analysen. Vi rapporterer også tilpasningen av vår vannbasert analysen metode å imøtekomme gram-positive bakteriell patogen Enterococcus faecalis. Som P. aeruginosa, er E. faecalis stadig identifisert som en alvorlig nosocomial trussel med en voksende armament resistensutvikling veier1. Selv om en tidligere metode for høy gjennomstrømming screening av E. faecalis finnes14, krever det preinfection med patogen, som kompliserer prosedyren og øker sannsynligheten for forurensende utstyr som COPAS FlowSort. Våre protokollen eliminerer behovet for pre-smitte, forbedre sikkerhet profilen. Til slutt, vi rapporterer et middel som en av disse analyser kan kombineres med mating RNAi, tillater brukeren å søke for vert faktorer som spiller en rolle i etableringen av, eller resistens mot infeksjon.
Denne analysen (eller lignende analyser der andre patogener ut P. aeruginosa eller E. faecalis) er nyttig for ulike formål, herunder medisiner. Det er også nyttig for å ta opp grunnleggende biologisk spørsmål, for eksempel identifisere virulens faktorer, utviklingen av vert forsvar trasé, og bestemme regulatoriske maskineriet involvert i interaksjonen som vert-patogen.
Selv om P. aeruginosa flytende drapet analysen er robust, finnes det flere punkter hvor forsi…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av kreftforebygging og Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, og den nasjonale institutter for helse K22 AI110552 til NVK. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
Cytation 5 | BioTek | ||
EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
Multitron Pro | Infors HT | ||
24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
Bacterial Strains | |||
P. aeruginosa (PA14) | |||
E. faecalis(OG1RF) | |||
E. coli superfood (OP50) | |||
E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
Worm Strains | |||
glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |