神経刺激誘導馬の左反回神経に近い自家幹細胞注入

リエージュ大学の動物の倫理的な使用のための委員会は、研究プロトコルを承認しました。 1. 筋 Microbiopsy 目視検査と触診、肘のポイントと肩のポイントの間の正中線約上腕三頭筋長頭でサンプル サイトを識別します。 電気クリッパーと約 2 × 2 cm2のゾーンをクリップします。クリップされた領域上の 1 分の polyiodide 液体石鹸とアルコール湿布から成る手術時手洗いを適用します。クリップと消毒ゾーンの中心に 25 G 針 2% リドカイン液の 1 mL 皮下注入します。 抗菌ハンドソープで手をスクラブします。滅菌手袋をつけます。生検針と、トロカールに置く滅菌表面として使い捨て滅菌ドレープを使用します。 図 1 bと1 cに示すようにバネ機構を引いて、半自動の 14 G 生検針を腕します。そのメカニズムに精通して得るために生検針をリリースします。滅菌の面に武装した生検針を置きます。トロカールは、カニューレと図 1に示すようにの閉鎖から成っているに精通を取得します。 図 1: 生検針セット。生検針のセットで構成されています (、) カニューレとその閉鎖と生検針 (上から下)。他のパネルの (b) に生検針を表示、中立的な (c) 武装の位置。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 カニューレと、閉鎖を組み立てることによって、トロカールを準備し、ロックされた位置でそれらを保ちます。以前鈍感ゾーンを介して皮膚に垂直に、トロカールを紹介します。トロカールの先端が約 1.5 cm の位置に、トロカールを進める筋肉の奥深くに。トロカールを取り出して、その閉鎖からカニューレを切り離して考えるし、滅菌表面上、閉鎖を置きます。 カニューレを通じて武装生検針をご紹介します。針と筋肉に皮膚切開カニューレを紹介します。上腕三頭筋の長頭の真ん中に針の先端がある位置に針を進めます。 生検針を解放し、カニューレと生検針を引き出します。カニューレから生検針を引き出します。滅菌の表面にカニューレを残します。 片方の手でスプリングを引っ張ってくると他でそれを保持して生検針を開きます。注: 試料が生検針の先端に表示されます。 2 番目の人の助けを借りて、サンプル中に含まれているサンプル チューブを開きます。19 G の注射針を使用して、生検針から小さな筋肉部分を削除します。サンプリング中に筋肉のサンプルを置きます。スクリュー キャップとチューブを閉じ、そっとそれを傾ける 2 x サンプルが中に浮いていることを確認します。 生検針を腕します。滅菌の表面からカニューレと武装した生検針とカニューレを再構築します。武装の針と前述したように、皮膚切開カニューレを紹介します。筋肉組織の約 20 mg のサンプリングまでに 2-3 x サンプル手順を繰り返します。サンプリング チューブを閉じます。優しく回すチューブ 2 サンプリング媒体と筋肉部分をミックスする x。 4 に 8 ° c の一定温度で研究室にサンプルを出荷します。注: 実験室は、サンプルを処理します。プロトコルはここで一時停止することができます。 プロシージャは忍し、サンプリング側に痛みは観測されていません。サンプリング サイトで観測された筋肉痛の万一の場合に、適切な鎮痛処置を管理します。 2. 細胞の治療 注: 本研究で使用されている幹細胞コースタースらによって記述されたメソッドによると準備されています。7. 自分の記事では、セルの特性についても説明します。 熱不活化ウシ胎児血清、ペニシリン (1,000 IU/mL) の 5 mL の 20% を追加することによって特定の培養培地、DF20 の準備-ストレプトマイシン (10,000 μ G/ml)、市販の 500 mL のボトルにアムホテリシン B (250 μ g/mL) の 2.5 mLグルタミンとフェノールレッド培。 24 マルチも皿の内側 16 井戸のそれぞれに DF20 培地の 150 μ L を注ぐ。残りのウェルにリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) [(200 mg/L) 塩化カリウム、カリウム リン酸単相性 (200 mg/L)、塩化ナトリウム (8,000 mg/L)、およびダイフェーズ リン酸カリウム (2,160 mg/L) 】 の 1 mL を注ぐ。 リンス小さな筋肉の部分 PBS で 2 倍。メスと鉗子の助けを借りて、非常に小さな断片に分割する、ウェルの皿の各内側 – 16 (メスの刃の先端のサイズ) の小片を置きます。 次の条件で維持インキュベーター多よく皿を配置: 37 ° C、21% O2、および 5% CO2。井戸を倒立顕微鏡下で毎日監視し、セルが乾くを防ぐために必要に応じて DF20 の 50 μ L を追加します。注: 約 10 d 後十分な細胞を幹細胞の隔離を許可する外植体から成長があるでしょう。プロトコルはここで一時停止することができます。 外植体細胞のハローが、筋肉の周り表示のとき、筋肉組織の外植体を破棄します。各ウェルにトリプシン EDTA を含むソリューションの 150 μ L を使用してセルを切断: 文化媒体を廃棄し、1 ml の PBS のセルを洗浄、破棄、PBS、37 ° C で最大 10 分のトリプシン溶液を追加トリプシンの作用を停止、細胞懸濁液を収穫し、37 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞懸濁液を遠心し、培養培地を追加します。上澄みを廃棄し、バランスの取れた塩溶液でペレットを中断します。 3 層 (15%、25%、35%) の不連続密度勾配の細胞懸濁液を転送します。細胞懸濁液および 25 ° C で 20 分間 1,250 x gで不連続密度勾配ソリューションを含むチューブを遠心分離します。遠心のブレーキを使用しないでください。遠心分離後不連続密度勾配液の異なる層の間に表示される密度の異なる細胞画分を観察します。 15 と 25% の間の小数と文化を続行します。管に転送し、バランスの取れた塩溶液で洗ってください。37 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。DF20 の 1 mL にペレットを中断するのに進みます。DF20 の 6 mL で 25 cm2の表面で細胞培養用フラスコを自動設定します。事前の細胞培養用フラスコにセルを転送し、それらを以下の条件でインキュベーターで文化: 5% CO221% O2、37 ° C。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 毎日倒立顕微鏡下で細胞を監視します。必要に応じて培養液を変更 (古い媒体を廃棄し、新しい培養液 6 mL を追加)。光学顕微鏡を使用して、定義済みの倍率で培養皿の細胞層を観察することによって細胞の合流を決定します。細胞で占められている皿の表面を推定します。合流点を評価できるようにすべての観察のための固定顕微鏡倍率で動作します。セルは、皿の表面の 85% を占め、細胞の通路を進みます。 セルが合流、ステップ 2.4 で説明されているように同じプロトコルでトリプシン EDTA を含むソリューションを使用して分離します。その後、37 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、DF20 の 5 mL のセルの巻き上がりを続行します。DF20 の 25 mL が充填された 175 cm2の細胞培養用フラスコに入れます。以下の条件でインキュベーターでフラスコを配置: 37 ° C、21% O2、および 5% CO2。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 毎日倒立顕微鏡下で細胞を監視します。必要に応じて、メディアを変更 (古い媒体を廃棄し、新しい媒体の 30 mL を追加)。セルが合流、ステップ 2.4 で説明されているようにトリプシン-EDTA を使用して分離します。その後、37 ° c. で 10 分の 200 x gで細胞懸濁液を遠心分離します。上澄みを廃棄し、DF20 の 6 mL のセルを中断します。6 175 cm2フラスコに細胞懸濁液の場所 1 mL、DF20、25 mL が充填された、37 ° c (21% O2と 5% CO2) CO2インキュベーターでそれらを文化します。 毎日倒立顕微鏡下で細胞を監視します。必要に応じて、メディアを変更 (古い培地を除去し、各フラスコに新しい媒体の 30 mL を追加)。セルが合流、2.5 の手順で説明されているようにトリプシン-EDTA を使用して分離します。それらを遠心分離機で 37 ° C と各ステップで上清を捨て 10 分の 200 x gで 3 倍。 カウントと光学顕微鏡 Bürker の助けを借りてのセルをカウントします。特定の凍結保存中の 1000 万セル/mL の細胞懸濁液を準備します。 1 x 107細胞凍結保存培地 1 mL の用量を急速冷凍、液体窒素の気相での使用まで保管します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 最終的な使用のドライアイスにバイアル内のセルを出荷します。 3. セルの注入 注: 幹細胞の注入を実行するには、2 人が必要。 部屋の温度に徐々 に細胞懸濁液を温めます。懸濁液を 2 mL 注射器に吸引します。 馬を頚静脈に 19 G の注射針のデトミジン 10 μ g/kg を注入することで落ち着いた。馬の特性のヘッドダウン位置によって見えるようになります鎮静の完全な効果をして 5 分待ちます。 図 2に示すように、クリッパーで馬の左喉頭領域に 20 × 10 cm2のゾーンをクリップします。クリップされた領域に、手術時手洗い法 polyiodide 石鹸とアルコールを適用します。 馬の左の鼻孔を通して柔軟な標準ビデオ内視鏡を置き、鼻咽頭に向かって進みます。披裂軟骨と喉頭蓋の両方の完全なビューを取得するまでは、内視鏡の位置を調整します。プロシージャの間にこの位置に内視鏡を保持し、演算子に対する内視鏡の画面を有効にします。 神経刺激装置の否定的な電極に刺激/注射針を接続します。針の無菌状態を維持します。神経刺激装置の肯定的な電極を切り取られた皮膚の領域に立ち往生している電極パッチに接続します。 注入ラインに細胞懸濁液の入った注射を接続し、システムの空気を追跡するチューブを自動設定します。システムの音量を覚えて、同じ滅菌生理食塩量の注射器を準備します。 この手法に慣れていない場合、は、関心領域の解剖学的構造を可視化する消毒 5 に 7 MHz リニア超音波探触子を使用します。滅菌された超音波ゲルを結合を使用して、画質を上げます。喉頭及び喉頭の背側領域で実行される容器を視覚化します。 一度領域の解剖学に精通している、喉頭の背側面に向かって刺激/注射針をご紹介します。喉頭の背側面に近づくと、神経刺激装置 2 の電流で 1 Hz 刺激モードで起動 mA。 そっと観察内視鏡画面観ながら反回神経の位置へ針を移動します。左披裂軟骨の外転運動、ビデオ画面に表示されて、すぐに場所に針を保ちつつ、動きが消えるまで電流を低減します。 針の理想的な位置を識別します。0.5 でモーター応答の損失と見なす神経から理想的な距離として mA。披裂軟骨の動きが 0.4 より低い電流で保持するとき mA、intraneuronal 注入が発生すると、セルを挿入しません。 0.5 mA, モーター応答の損失 107自家幹細胞を含む細胞懸濁液を注入し、準備生理食塩液を注入ラインをフラッシュで 3.6 はステップします。これは、注射筒に残った細胞の懸濁液の残りの部分を挿入します。 細胞の投与、針と内視鏡を取る。 馬の鎮静からの回復をしましょう。生検のためにそれ以上の治療は不要です。