Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.
Abstract
Die schnelle Diagnose einer Infektion ist entscheidend für den Ausbruch Management, Risiko Containment und Patientenversorgung. Wir haben zuvor eine Methode für die schnelle am Krankenbett Inaktivierung des Ebola-Virus während der Blutentnahme für sichere Nukleinsäure (NA) Tests gezeigt, indem man einen kommerziellen Lyse/Bindung Puffer direkt in das Vakuum Blutentnahmeröhrchen. Mit diesem Ansatz am Krankenbett Inaktivierung, entwickelten wir eine sichere, schnelle und vereinfachte am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die spätere Entdeckung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom.
Nachdem das Blut in den Lyse/Bindung Puffer gesammelt, die Inhalte werden durch Umklappen das Rohr von hand gemischt und die Mischung wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Magnetische Glaspartikeln (Map) werden hinzugefügt, um das Rohr, und der Inhalt sind durch Umklappen das sammelröhrchen von hand gemischt. Die Map werden dann auf der Seite das blutsammelröhrchen mit einem Magnethalter oder ein Magnet und ein Gummiband gesammelt. Die Map werden dreimal gewaschen, und nach der Zugabe der Elution Puffer direkt in das sammelröhrchen, die NAs sind bereit für NA-Tests, wie qPCR oder Isothermen Schleife Verstärkung (Lampe), ohne die Entfernung von der Map aus der Reaktion. Die NA-Extraktions-Verfahren ist nicht abhängig von jedem Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten und Krankenhaus Isolierstationen) verwendet. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares Gerät kombiniert wird, erhalten Sie eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.
Introduction
In Virus Ausbruch Situationen wenn Patienten auf das Krankenhaus Isolierstationen oder wenn eine schnelle Diagnose benötigt wird beschränkt sind, ist eine sichere, einfache und genaue Molekulare Diagnostik der Point-of-Care unerlässlich, dass die Patienten Pflege und Risiko Containment. Die zwei jüngsten virale Ausbrüche, das Ebola-Virus (EBOV) in Westafrika (2013) und der Zika-Virus in Südamerika (2015), haben das Interesse an verbesserte Point-of-Care Molekulare diagnostische Tests, wie z. B. reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen erhöht. Verstärkung (RT-Lampe)1,2 und Rekombinase Polymerase Verstärkung (RPA)3,4. RT-Lampe und RPA sind schnelle, sensitive und spezifische Molekulare Tests, die auf vereinfachtes Beispiel Vorbereitungen durchgeführt werden können. Für das Zika-Virus wurde RT-Lampe mit einem lateralflow-Assay (LFA), kombiniert die Zika-Virus in Vollblut-gereinigte Proben innerhalb von 30 min1erkennen kann; für EBOV, das ist ein Risiko-Gruppe 4-Pathogen eingestuft und ist hoch ansteckend, die Proben müssen jedoch unter Biosafety behandelt werden Stufe 4 (BSL-4) Bedingungen und inaktiviert werden, bevor eine sichere diagnostischen Verfahren durchgeführt werden können.
Vereinfachte Inaktivierungsverfahren für EBOV, wie die Zugabe von Lyse Puffer auf die Probe2,3,4,5, dienten während des Ausbruchs; Diese Methoden erfordern jedoch Handhabung BSL-4 Bedingungen mit Laborgeräten, wie BSL-3 Biosafety Schränke, Zentrifugen, Heizblöcke und Pipetten, auf ein Minimum. Dieses Gerät ist normalerweise nicht vorhanden, Isolierstationen oder in Feldlazaretten. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden Versuche unternommen, im Koffer3Diagnostik durchzuführen, und mehrere tragbare Geräte und Maschinen wurden entwickelt [z. B.ein tragbares Gerät zur Gewinnung von Nukleinsäure (NA)]6. EBOV-positiven Proben müssen jedoch noch inaktiviert werden, bevor diese Geräte verwendet werden können.
Wir haben zuvor eine schnelle am Krankenbett Virus-Inaktivierung-Methode zur EBOV7, Vaccinia Virus und Kuhpocken-Virus8 durch Zugabe eines kommerziellen Lyse/Bindung-Puffers zu gewöhnlichen Vakuum Blutentnahmeröhrchen, berichtet ermöglicht den direkten Übertragung von Blut aus dem Patienten in die Inaktivierung Puffer7. Diese direkte und sofortige Inaktivierung in einem geschlossenen System eliminiert die Notwendigkeit für die Proben unter Verwendung strikte Einschließung, z. B. BSL-4 Bedingungen7, Handhabung und die Proben können unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Diese Inaktivierung Methode ist kompatibel mit mehreren NA Absauganlagen, wie Roboter und Hand-Reinigung-Kits-7; Diese Methoden erfordern jedoch Laborgeräte wie Roboter, Zentrifugen und Elektrizität, die nicht immer in den Bereich Einstellungen oder im Krankenhaus Isolierstationen vorhanden sind.
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und vereinfachte manuelle NA Extraktionsmethode für die anschließende molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktions-Verfahren erfordert keine Geräte außer einem Magnet/Magnethalter. Für die NA-Extraktion werden keine Zentrifugen, Heizung, Blöcke oder Strom benötigt. Daher, diese Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten in Isolation Krankenstationen oder mit geringen Ressourcen Einstellungen) verwendet. Die NA-Extraktions-Verfahren ist schnell und einfach und kann direkt in alle nachgelagerten NA-Tests wie qPCR, RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe verwendet werden. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares batteriebetriebenes Isothermen Instrument kombiniert wird, erhalten Sie eine Nachttisch Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und einfache manuelle am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die nachgelagerten molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um direkt auf Vollblut-Proben im Vakuum Blutentnahmeröhrchen, enthält die Lyse/Bindung Puffer (Table of Materials)7durchgeführt werden. Dieser spezielle Puffer inaktiviert EBOV7 u…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Susanne Lopes Rasmussen und Solvej Kolbjørn Jensen für ihre technische Unterstützung und für den Umgang mit der klinischen Proben. Dieses Projekt ist Teil des Konsortiums EbolaMoDRAD, die Mittel aus der innovativen Medizin Initiative 2 gemeinsamen Unternehmens unter Grant Vereinbarung N ° 115843 erhalten hat. Dieses gemeinsame Unternehmen erhält Unterstützung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm und EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
Referencias
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