Saccharomyces cerevisiae Metabolsk merking med 4-thiouracil og kvantifisering av nylig syntetisert mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Cellene reagerer endogene og eksogene Stikkordene, gjennom dynamisk endring av gene expression programmet. De siste årene tillater en enorm utvikling av genomet hele metoder presis og omfattende beskrivelse av transcriptome endringer i ulike forhold. I de fleste transcriptomic studier brukes microarray hybridisering eller høy gjennomstrømming sekvensering å kvantifisere RNA nivåer fra en total stabil RNA brøkdel. Transcriptional endringer under en bestemt forstyrrelsene kan vise en rekke mulige utfall, bestemte genet uttrykk endringer eller et stort spekter av gener enten opp – eller downregulated. Genuttrykk er resultatet av en finjustert likevekt- eller stabil-mellom RNA syntese av RNA-polymerases og andre prosesser påvirker RNA nivåer. RNA polymerase II transkripsjon, inkludert sine tre distinkte faser (initiering, forlengelse, og oppsigelse), er svært og intrikat knyttet mRNA behandling, cytoplasmatiske eksport, oversettelse og fornedrelse.

Flere studier har vist at mRNAs syntese og nedbrytning er kombinert mekanismer og viste at transcriptional effekter på mutasjon eller under stimuli kan bli oversett når kvantifisere totale stabil RNA. Først avhenger gjenkjenning av transcriptional endringer gjennom analysene av stabil mRNA alltid mRNAs half-life. Når forstyrrelsene er innført, vil stabil nivåene av mRNAs med lang halv-liv bli mye mindre påvirket enn mRNAs med kort halv-liv. Derfor er detectability av endringene i RNA syntese sterkt partisk i favør av kortvarige transkripsjoner, mens analyse av longer-lived mRNA arter svikter å avsløre dynamiske endringer i transkripsjon rate. Andre flere rapporter har vist at både i gjær og pattedyr, globale endringer i transkripsjon kan overses når du analyserer stabil nivåer av mRNA. Det skyldes sannsyligvis mekanismer som kobler mRNA syntese og nedbrytning resulterer i mRNA bufring. Dette bedt om utviklingen av nye protokoller for å kvantifisere mRNA syntese uncoupled fra fornedrelse, gjennom analysen av nylig transkribert mRNA. De siste årene har flere alternativer er blitt presentert, inkludert globale løpe sekvensering (GRO-seq)¹og opprinnelig forlengelse transkripsjon sekvensering (NET-seq)^2,3. Her presenterer vi en protokoll opprinnelig utviklet i pattedyrceller^4,5,6 og deretter tilpasset gjær^{7,8,9,10, 11}, som er basert på RNA merking med thiolated nukleosid eller base analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), henholdsvis.

Denne metoden spesielt renser nylig transkribere RNA fra cellene i hvilke RNA er puls-merket med 4sU med faktisk nei innblandingen i cellen homeostase. Derfor, når cellene er utsatt for 4sU, molekylet er raskt uptaken, fosforylert til 4sU-trifosfat, og innlemmet i RNAs blir transkriberte. Når puls-merket, er det mulig å trekke samlede mobilnettet RNA (tilsvarende stabil nivåer av RNA), og deretter 4sU-merket RNA brøkdel er thiol-spesielt endret, fører til dannelsen av en disulfide obligasjon mellom biotin og nylig transkribere RNA^4,5. 4sU kan imidlertid bare uptaken av celler som uttrykker en nukleosid transporter, som den menneskelige equilibrative nukleosid transporter (hENT1), hindrer dens bruk i spirende eller fisjon gjær. Mens man kunne uttrykke hENT1 S. pombe eller S. cerevisiae, kan lettere tilnærming oppnås ved hjelp av den endrede base 4tU, siden gjærceller kan ta opp 4tU, uten behovet av uttrykk for en nukleosid transporter^{10, 11 , 12 , 13}. faktisk metabolismen av 4tU krever aktiviteten av enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I flere organismer, inkludert gjær men ikke pattedyr, er UPRT avgjørende for en pyrimidine berging sti, gjenvinning uracil å uridine monofosfat.

En viktig skjevhet i transcriptomic studier kan bli introdusert ved normalisering mellom forskjellige prøver analysert parallelt. Faktisk mange avvikende faktorer kan påvirke komparativ analyse av transcriptome mutant og vill-type stammer: effektiviteten av cellen lysis, forskjeller i utvinning og gjenoppretting av RNA og varians i skannerkalibrering for microarray analyser , blant andre. Som drøftet over, kan slike variasjoner være spesielt villedende når global effekter på RNA polymerase II transkripsjon forventes. En elegant betyr å nøyaktig sammenligne mRNA syntese priser mellom ulike eksempler ble utviklet ved hjelp av fjernt beslektede fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe som interne standard. For at et bestemt antall merket S. pombe celler legges til S. cerevisiae prøvene, vill-type eller mutant celler, før cellen lyse og RNA utvinning¹⁰. Deretter er både stabil og nylig syntetisk RNAs S. pombe og S. cerevisiae kvantifisert RT-qPCR eller via bruken av microarray chips eller høy gjennomstrømming sekvensering¹⁰. Kombinere disse dataene med kinetic modellering, kan absolutt priser mRNA syntese og nedbrytning i spirende gjær måles.

I rammen av dette manuskriptet, vil vi vise hvordan analyse av nylig transkribere RNA lov for å avsløre en global rolle for coactivator komplekser SAGA og TFIID i RNA polymerase II transkripsjon i spirende gjær^{14,15, 16}. Viktigst, tidligere studier kvantifisert stabil mRNA nivåer i S. cerevisiae og foreslo at SAGA spiller en dominerende funksjon på et begrenset sett med gjær gener som er sterkt berørt av mutasjoner i SAGA, men relativt motstandsdyktig mot TFIID mutasjoner^17,18,19. Overraskende, ble SAGA enzymatisk aktiviteter vist å handle på hele transkribert genomet, antyder en bredere rolle for denne co aktivator i RNA polymerase II transkripsjon. Redusert RNA polymerase II rekruttering på mest uttrykt gener ble observert på inaktivering av SAGA eller TFIID, noe som tyder på at disse coactivators samarbeider på de fleste gener. Derfor viste kvantifisering av nylig transkribert mRNA at SAGA og TFIID er nødvendig for transkripsjon av nesten alle gener av RNA polymerase II^14,15,16. Gjennomføringen av kompenserende mekanismer fremstår som en måte for cellene å takle en global reduksjon i mRNA syntese som er bufret av en samtidige global nedgang i mRNA degradering. SAGAEN legger til listen over faktorer å ha en global effekt på RNA polymerase II transkripsjon, for eksempel RNA Pol II underenheter¹⁰, megler coactivator komplekse²⁰, generelt transkripsjon faktor TFIIH^21,22 , og indirekte, elementer av mRNA fornedrelse maskiner^9,10,23. Slike kompenserende hendelser ble universelt observert i SAGA mutanter, regnskap for beskjeden og begrenset endringene i stabil mRNA nivåer til tross for en global og alvorlig nedgang i mRNA syntese¹⁴. Lignende analyser ble også utført i en BRE1 sletting belastning, som resulterer i et fullstendig tap av histone H2B ubiquitination. Interessant, en mye mildere men konsekvent global effekt på RNA polymerase II transkripsjon ble oppdaget i fravær av Bre1, som indikerer at metabolsk merking av nylig transkribere RNA i gjær kan oppdage og kvantifisere en rekke endringer i mRNA syntese priser.