Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

세포는 유전자 식 프로그램의 동적 변경 통해 내 인 성 및 외 인 신호에 응답. 최근 몇 년 동안, 게놈 넓은 방법론의 엄청난 개발 다른 조건 transcriptome 변화의 정확 하 고 포괄적인 설명 수 있습니다. 대부분 transcriptomic 연구, microarray 교 잡 또는 높은 처리량 시퀀싱 총 정상 RNA 분수에서 RNA 수준을 측정 하는 데 사용 됩니다. 특정 섭 동 아래 transcriptional 변경 가능한 결과, 특정 유전자 표현 변경 또는 업 또는 downregulated 되 고 유전자의 큰 스펙트럼의 넓은 범위를 표시할 수 있습니다. 유전자 발현은 미세 조정된 균형의 결과 이다-또는 정상-RNA polymerases에 의해 RNA 합성 및 RNA 수준에 영향을 미치는 다른 프로세스 사이. Rna 중 합 효소 II 전사, mRNA 처리와 세포질 수출, 번역, 저하 고 복잡 하 게 연결 됩니다 (개시, 신장, 그리고 종료), 그것의 세 가지 단계를 포함 하 여.

여러 최근 연구 mRNAs 합성 및 부패는 결합된 메커니즘을 설명 하 고 총 정상 RNA를 측정 하는 때 돌연변이 또는 자극 아래 transcriptional 효과 간과 될 수 보였다. 첫째, 항상 정상 수준의 mRNA의 분석을 통해 transcriptional 변화의 감지는 mRNAs 반감기에 따라 달라 집니다. 섭 동을 도입 되 면 긴 반감기를 가진 mRNAs의 정상 수준 것입니다 훨씬 덜 영향을 보다 짧은 반감기를 가진 mRNAs의. 따라서, 단기 성적에 찬성 하 여 RNA 합성에 변경의 검출 바이어스 강하게 동안 최소로 mRNA 종 분석 전사 율에서 동적인 변화를 공개를 실패할 수 있습니다. 둘째, 여러 개의 보고서, 모두 효 모와 포유류에서 전사에 글로벌 변화 수 있습니다 간과 mRNA의 정상 수준을 분석할 때 나타났습니다. 이것은 mRNA 합성 및 mRNA 버퍼링 결과 저하를 연결 하는 메커니즘으로 인해입니다. 이 mRNA 합성 저하, 새로 베 껴 진된 mRNA의 분석을 통해에서 상태로 계량 하 새로운 프로토콜의 개발을 자극. 최근 몇 년 동안, 여러 가지 대안 되었습니다 제시, 글로벌 실행 시퀀싱 (GRO-seq)¹및 네이티브 신장 시퀀싱 (NET-seq)^2,3를 포함 하 여. 여기, 우리는 포유류 세포^4,,56 에서 처음 개발 하 고 다음 효 모^{7,,89,10에 적용 하는 프로토콜을 제시 11}, thiolated nucleoside 또는 기본 아날로그로 RNA 기반 4-thiouridine (4sU) 또는 4-thiouracil (4tU), 각각.

이 메서드는 특별히 새로 베 껴 진된 RNA는 RNA의 세포에서 정화 펄스 장애 요소가 없으면 세포 항상성에서 4sU로 표시 됩니다. 따라서, 일단 셀 4sU에 노출은, 분자는 빠르게 uptaken, 4sU 3 인산 염에 phosphorylated 및 RNAs 변하게 되 고에 통합. 일단 수정 펄스-분류, 추출 총 세포질 RNA (RNA의 정상 수준에 해당), 수 이며, 그 후, 4sU 라는 RNA 분수 thiol 특히 biotin 사이 이황화 결합의 형성으로 이어지는 고 새로 베 껴 진된 RNA^4,5. 그러나, 4sU는 인간의 equilibrative nucleoside 운송업 자 (hENT1), 신진 또는 분열 효 모에의 즉시 사용을 방지 같은 nucleoside 전송기를 표현 하는 세포에 의해 uptaken를 하실 수 있습니다. 하나는 S. pombe 또는 S. cerevisiae에서 hENT1을 표현할 수 있는, 하는 동안 쉽게 접근 달성 될 수 있다 효 모 세포 nucleoside 전송^10, 의 식의 필요 없이 4tU 최대 걸릴 수 있습니다 이후 수정 된 기본 4tU를 사용 하 여 ^{11 , 12 , 13}. 4tU의 대사 효소 uracil phosphoribosyltransferase (UPRT)의 활동을 필요로 하는 사실. 효 모만 아니라 포유류를 포함 한 여러 유기 체에서 UPRT uridine monophosphate uracil 재활용 pyrimidine 회수 경로 대 한 필수적입니다.

동시에 분석 하는 다른 견본 사이의 정규화 transcriptomic 연구에 중요 한 바이어스를 도입 수 있습니다. 실제로, 많은 일탈 요인 돌연변이 및 야생-타입 긴장의 transcriptome의 비교 분석을 영향을 미칠 수: 세포 세포의 용 해 효율 추출 및 RNA, 및 분산 microarray 분석에 대 한 스캐너 교정에서의 복구에 차이 다른 사람의 사이에서. 위에서 설명 했 듯이, RNA 중 합 효소 II 전사에 글로벌 효과 예상 되는 등 유사 특히 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 정확 하 게 다른 견본 사이의 mRNA 합성 레이트를 비교 하는 우아한 의미 내부 표준으로 먼 관련된 분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 를 사용 하 여 설계 되었다. 고정 된 수의 표시 S. pombe 셀 S. cerevisiae 샘플, 야생-타입 또는 돌연변이 세포, 세포 세포의 용 해 및 RNA 추출¹⁰이전에 추가 됩니다. 그 후, S. pombe 와 S. cerevisiae 에서 정상 상태와 새로 합성 RNAs 실시간 정량 또는 통해 microarray 칩 또는 높 처리량 연속¹⁰의 사용에 의해 정량은. 이러한 데이터를 결합 하 여 운동 모델링, mRNA 합성 및 싹 트는 효 모에는 감퇴의 절대 속도 측정할 수 있습니다.

이 원고 틀에서 새로 베 껴 진된 RNA 분석 신진에 RNA 중 합 효소 II 전사에서 coactivator 단지 사가 TFIID^{14,15, 효 모에 대 한 글로벌 역할을 허용 하는 방법을 살펴보겠습니다. 16}. 중요 한 것은, 과거의 연구 S. cerevisiae 에서 정상 mRNA 레벨을 계량 및 제안 사가 사가 돌연변이 의해 강하게 영향을 하지만 상대적으로 TFIID를 저항 하는 효 모 유전자의 제한 된 집합에 주된 기능을 담당 변이^17,,1819. 놀랍게도, 사가 효소 활동 전체 베낀된 게놈 RNA 중 합 효소 II 전사에이 공동 활성이 제에 대 한 광범위 한 역할을 제안에 따라 행동을 표시 했다. 가장 표현된 유전자에서 감소 RNA 중 합 효소 II 모집 사가 또는 이러한 coactivators 대부분 유전자에서 함께 일 하는 것을 건의 하는 TFIID의 비활성화에 관찰 되었다. 따라서, 새로 베 껴 진된 mRNA의 정량화 사가 TFIID RNA 중 합 효소 II^14,,1516에 의해 거의 모든 유전자의 전사에 대 한 요구는 밝혔다. 보상 메커니즘의 구현 mRNA 저하에서 동시 글로벌 감소에 의해 버퍼링 되는 mRNA 합성의 글로벌 감소에 대처 하기 위해 셀에 대 한 방법으로 나온다. 사가 녹음 방송 요인 TFIIH^{21,22에 RNA 중 합 효소 II 전사, RNA Pol II subunits10등 글로벌 효과, 중재자 coactivator 복잡 한20, 일반 요인의 목록에 추가} , 그리고 간접적으로, mRNA 저하 기계^9,,1023의 요소. 이러한 보상 이벤트 사가 돌연변이, 정상 mRNA 수준의 mRNA 합성¹⁴글로벌 하 고 심각한 감소에도 불구 하 고 겸손 하 고 제한 된 변화에 대 한 회계에서 보편적으로 관찰 되었다. 비슷한 분석 또한 히스톤 H2B ubiquitination의 완전 한 손실을 BRE1 삭제 스트레인에서 수행 했다. 흥미롭게도, 많은 온화한 그러나 일관 된 글로벌에 대 한 효력이 RNA 중 합 효소 II 전사는 감지 하 고 다양 한 mRNA에 변화를 계량 수 있습니다. 효에서 새로 베 껴 진된 RNA의 대사 라벨을 나타내는 Bre1의 부재에서 검출 될 수 있습니다. 합성 비율입니다.