ダイコン品種使用 PNGase H⁺からN型糖鎖の解析

植物におけるN型糖鎖が注目増加近年、前の研究がアレルギー反応^{1,2 を引き起こすかもしれない免疫の内の潜在的なソースとしてN型糖鎖をハイライト表示します。}.それが実証されて以前植物糖タンパク質糖鎖のNは、触媒活性^3,4、耐熱性と折りたたみ式^5,6または細胞レベル下のローカリゼーションに影響を与えることができ、分泌⁷。糖鎖構造をそれぞれの機能に関連付ける、するためにN型糖鎖最初から解放しなければならない糖タンパク質化学的にまたは酵素によって。N– とO型糖鎖を解放するための古典的な化学方法は β-除去するアルカリ サンプル治療と一緒に伴われる還元糖アルコール⁸を生成する水素化ホウ素。ただし、この手順は、蛍光でラベルを排除、糖鎖構造の還元末端から単糖類の単位の重要な崩壊を引き起こします。水酸化アンモニウム炭酸塩治療に基づいて化学糖鎖切り出しも一般的に使用される代替方法⁹です。これらの化学物質の放出方法のどちらも同じ質量範囲にラベルのない糖ペプチド フラグメントの干渉なしプールの質量分析が可能そのまま蛋白質が低下します。ただし、これらのメソッドの 1 つの欠点である α 1, 3 次N型糖鎖の増加の分解速度は共通の炭水化物構造植物¹⁰。また、ペプチドを用いた酵素リリース方法:N– 多糖分解酵素 (PNGases、EC 3.5.1.52) も広く適用されています。(病菌 meningosepticum) から組換え PNGase F は最も一般的な選択であり、コア α 1, 3 フコース^11,12軸受構造を除いて、 N型糖鎖のすべてのタイプのリリースを許可します。したがって、PNGase A (アーモンドの種子から分離された) は通常植物¹³ N型糖鎖の解析に使用されます。しかし、この酵素 deglycosylates のみ生由来ペプチド、deglycosylate ネイティブ糖¹⁴ことができないと。したがって、詳細な分析、糖、低豊富¹⁵の特にそれらの広汎な損失を引き起こす前にマルチ ステップ サンプル精密検査が必要です。メソッドの全体的な目標は、 N型糖鎖のリリースとシンプルで堅牢な方法で蛍光のために最適化されたワークフローを提示することです。基になる根拠は PNGase H⁺ Terriglobus ニチニチソウの最近発見された recombinantly , 大腸菌で発現することができます、ことができる酸性のタンパク質足場から直接N型糖鎖を加水分解条件¹⁶。PNGase H⁺を使った代替方法の主な利点は、反応バッファー^17,18を変更することがなく同じ反応管内の蛍光標識反応が可能です。簡単な調製条件と低豊富なオリゴ糖の高回収率このメソッドは、 N型糖鎖の解析で貴重なツールを作る。このプロトコルは、さまざまな植物の種からN型糖鎖の解析に適しています。