基于尸检的野生鱼类健康评估

这里描述的方法已被 Leetown 科学中心的机构动物护理和使用委员会批准。 1. 收集鱼类 用最少的压力收集活鱼。使用船或背包 electrofishing, 钩和线或网。 将鱼放在活水井或充气容器中, 直到取样。注: 美国渔业学会已经出版了许多指南为鱼收集、处理和麻醉/安乐死26,27,28。处理鱼时要戴手套。 2. 鱼尸检 弄死一条鱼。 在麻醉中放置鱼, 直到鳃盖运动停止, 鱼失去平衡。再过2–10分钟, 鱼就会被安乐死;然而, 这也可能因物种而异。注: 鱼可以被安乐死与一些麻醉剂 (见材料表最常用)。安乐死的方法将取决于实验室测量, 将进行的组织收集29。 测量生物特征。 把鱼秤到最近的克。 测量鱼长到最近的毫米。 当捏在一起时, 用嘴巴闭合到尾部末端测量总长度从嘴尖。 测量从尾叉到鼻尖的叉子长度, 以及从鼻尖到身体末端 (尾部开始) 的标准长度。 使用以下公式计算条件系数:条件因子 = (总体重-性腺重量)/总长度3。注意: 性腺重量从总体重中减去, 因为性腺对总体重有很大的贡献, 特别是在 prespawn 的雌性鱼身上。 获取血液样本。注: 血液通常取自尾脉, 但也可从背主动脉或心脏穿刺30撤回。 根据鱼的大小, 在1到5毫升的注射器上从尾静脉提取外周血样本, 22 或23克针。将针插入前侧线下方的尾部区域 (图 1A和1B)。向上角, 直到击中脊柱, 然后略有撤回。静脉在上覆脊柱腹侧。注: 如果要进行血液涂片或血清是必需的, 没有抗凝剂使用。在大多数情况下, 血浆将被收集, 因此, 抗凝剂, 如肝素钠, EDTA 或锂被用来涂针和注射器, 也在采血管 (例如, vacutainer)。 在将血液放入收集管之前, 取出针并放入锋利的处理容器中。注: 血液可以在冰上举行, 但根据随后的分析应尽快离心30。 如果核异常或差异性血液计数将被评估, 立刻放置一滴血液在重复的干净的玻璃显微镜幻灯片。后面的第二张幻灯片在45°角度到下降, 然后通过毛细管行动绘制横跨表面。允许空气干燥31。 离心血液在 1,500–2,500 x g 15 分钟, 以沉积细胞。去除无菌转移吸管的血浆/血清, 整除进入低温瓶, 并贮存在摄氏-80 摄氏度。 图 1: 从鱼身上获取血液样本.(a) 最近的安乐死鱼放在其一侧和侧线处。(B) 针插入腹侧线 (箭头), 向上倾斜, 直到针接触骨干。然后, 它被轻微的撤回, 并开始抽吸血液。请单击此处查看此图的较大版本. 对每条鱼进行基于尸检的健康评估。注: 许多发表说明和描述病变和异常的出版物可提供32、33、34、35。 记录外部异常, 包括体表和鳍上的病变 (图 2), 眼睛和鳃 (图 3), 外部寄生虫如水蛭 (图 2D), 蛴螬或吸虫 metacercarial 囊肿 (图 2D,3B) 和鳃寄生虫 (图 3D)。文件类型, 在数据表上观察到的异常的位置和大小, 以及照相, 如果可能的话。 用剪刀切开腹腔 (图 4A), 从肛门区域切开到笼盖, 然后取出肌肉皮瓣以暴露内脏。注: 如果前肾脏将被收集免疫功能 (见步骤 5) 或收集的细菌学或病毒学样本, 外部身体表面应消毒70% 酒精和那些样本应该得到之前, 尸检执行。如果组织只是用于视觉观察, 血浆分析和病理学无菌技术是不必要的。 记录内部异常 (图 4), 包括各器官的一般或焦点变色 (图 4B-4D)、凸起区域的存在 (图 4E)、囊肿、寄生虫和大小异常 (扩大, 萎缩)。 图 2: 在体表和鱼鳍上观察可见病变的例子.(a) 侧面体表的小的轻微侵蚀病灶 (箭头)。(B) 涉及尾体表面的大变红区域 (箭头)。(C) 在体表和鳍上凸起、黑色病变 (箭头)。(D) 鳍上的水蛭 (白箭) 和小黑点 (黑箭)。刻度条 = 3 毫米 (E) 在体表上有凸起的、multilobed 的、苍白的病变 (箭头)。请单击此处查看此图的较大版本. 图 3: 鱼鳃和眼睛可见病变的例子.(a) 眼睛透镜内的苍白区域 (箭头)。刻度条 = 5 毫米 (B) 白色囊肿 (白色箭头) 和小黑点 (黑色箭头), 由吸虫寄生虫引起的笼盖覆盖鳃 (a)。刻度条 = 1 厘米 (C) 鳃 (a) 上的一个苍白的、侵蚀的区域 (箭头)。刻度条 = 5 毫米 (D) 已除去的鳃, 显示附着在鳃花丝上的寄生虫 (箭头)。刻度条 = 2 毫米.请点击这里查看这个数字的大版本. 图 4:鱼的尸检和内部异常的例子.(a) 在尸检期间, 鱼被切开 (沿白色箭头) 和一瓣肌肉 (黑箭头) 被去除暴露性腺 (A) 和脾脏, 由钳和剪刀举行。(b) 斑驳的肝脏 (a), 睾丸 (b), 肠周围脂肪脂肪 (c) 和胃 (d)。鳞片棒 = 5 毫米 (c) 肝 (a) 带暗红色区域 (箭头), 卵巢 (b) 和肠道 (c)。刻度条 = 5 毫米 (D) 肝带绿色变色区域 (箭头)。刻度条 = 1 厘米 (E) 正常 (a) 和异常 (b) 睾丸与凸起结节的例子。刻度条 = 1 厘米.请点击这里查看这个数字的大版本. 获得 hepatosomatic 指数 (HSI)。 通过切断肝动脉和前端结缔组织来去除肝脏。轻轻地抬起, 同时修剪粘连和其他与肠道和脂肪脂肪的连接。当心不要刺穿胆囊。重肝。注意: 有些鱼, 如鲤科鱼类, 没有分离的肝脏, 而是包裹在肠道和其他器官周围的肝组织。对于这些物种, 可能不可能获得肝脏重量。 使用公式计算 hepatosomatic 指数 (HSI):肝脏重量/总体重 计算 gonadosomatic 索引。 移除性腺并称量它。 使用公式计算 gonadosomatic 索引 (模拟器):性腺重量/总体重 3. 保存组织为显微病理学 注: 许多护包括10% 中性缓冲福尔马林和 Z 固定, 一种福尔马林为基础的定影剂与锌, 可用于保存在该领域的组织。如果可以使用原位杂交或荧光抗体染色等方法, 则首选后者。 小心切, 但不要拉出组织样本。保持单独的组织件 < 2 厘米大小和 < 5 毫米厚, 以适当的固定。作为一个经验法则, 使用大约10x 更多的固定体体积比组织, 以适当保存。将所有组织样本从一条鱼放在适当大小的同一个防漏容器中, 这取决于取样的鱼的大小。 放置在固定容器中的任何外部异常件。另外, 还要包括一条相邻的正常组织。注意: 诸如压缩或其他机械损坏、长时间暴露在空气或阳光下、冻结等不当处理会造成工件。 从不同地区切开至少五3–4毫米厚的肝脏, 放入固定容器中。包括正常和异常区域, 如果观察到。 根据大小, 放置一个完整的性腺或多个部分沿一个性腺进入固定容器。 安置器官, 如果小, 或所有其他器官 (脾脏, 前和后肾, 鳃, 心脏, 肚腑和胃) 片断在固定容器。如果观察到异常组织, 则保留相邻的一条正常组织。 4. 删除年龄分析的耳石 注意: 年龄可能是鱼类疾病/鱼类健康研究中的一个重要变量。虽然许多结构, 包括鳞片和刺, 已被用于年龄确定, 大多数研究比较结构已发现耳石给出最好的结果36,37。硬骨鱼类鱼有三对耳石-lapillus, 箭和 asteriscus。通常, 矢状或 lapillus 耳石是为衰老而收集的, 尽管可能因物种而异。去除和老化技术以前被描述了38。 穿过鳃峡, 然后向后弯曲。剥去在脑颅的下部分周围的结缔组织和肌肉组织, 以找到 prootic 水疱, 一个凸起的骨区。 用骨切割器和裂纹切开耳石。肉眼可以看到它们。 将耳石放置在标签小瓶或硬币信封中, 并在室温下存储, 直到通过计数圆环或增量38来分析年龄。如果放置在一个瓶子, 打开帽曾经返回实验室, 并允许彻底干燥之前, 储存。 图 5: 去除耳石.(A) 峡部被切断, 结缔组织和肌肉拉走, 以暴露脊柱和 neurospinal 地区的基础。(B) 骨头裂开, 露出耳石。(C) Lapillar 耳石被删除。请单击此处查看此图的较大版本. 5. 获得免疫功能测定用组织 注: 前肾脏是主要的造血器官, 淋巴细胞和巨噬细胞的来源为功能性化验, 必须去除灌装如果细胞将培养的功能化验, 如 mitogenesis, 吞噬和杀死能力巨噬细胞39,40。 用70% 乙醇喷洒鱼的外部表面。使用无菌剪刀, 手术刀和镊子打开腹腔, 并删除前肾脏组织, 这是一个黑暗的红色器官位于前的游泳膀胱。 将前肾脏标本放在培养基中 (例如,莱博维茨的 L-15) 以保持细胞存活。融汇肾标本与无菌手持组织磨床 (如Tenbroeck 组织磨床) 成单细胞悬浮液。坚持湿冰, 直到返回实验室。 6. 保存核酸分析用组织 注: 如果下游分子分析将进行, 如基因表达使用转录丰度41或定量 PCR42 (聚合酶链反应), 放置在适当的防腐剂评估组织片断 (例如, RNAlater 稳定解决方案) 尽快。 为 RNA 保存, 放置二到三小 (2–3毫米) 片断在适当的防腐剂在10:1 防腐剂容量的比率到组织。注: 样品应保护免受阳光或过热, 并在湿冰运输。 为脱氧核糖核酸保存, 安置二到三个小片断组织入95% 乙醇 (10:1 乙醇对组织按容量)。然后把样品放在湿冰上, 然后存放在-20 摄氏度。