Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del^1,2. Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer^3,4. Por lo tanto es crucial investigar y comprender mejor los mecanismos de splicing alternativos en un intento de encontrar nuevos tratamientos de enfermedades humanas.

COMO a menudo se regula de manera específica de tipo celular. Es importante determinar el patrón de expresión de AS de un gen específico en un sistema biológico dado. Sin embargo, esto se complica cuando se estudia un órgano complejo que contiene muchos tipos diferentes de células, como el cerebro o el corazón. En este caso, una opción ideal de sistema de ensayo es RNA en situ hibridación (ISH utilizando) las secciones por lo que el modelo AS de expresión de un gen específico puede ser detectado en muchos tipos celulares simultáneamente. De hecho, se han utilizado sondas exón específico para evaluar los niveles de expresión de un exón alternativo^5,6,7. Sin embargo, este enfoque no es adecuado para análisis del patrón por las siguientes razones. En primer lugar, convencionales métodos ISH suelen utilizan sondas de más de 300 bp, mientras que el tamaño promedio de exones internos vertebrados (no primer o último exón) es 170 nucleótidos^8,9. En segundo lugar, cuando una sonda de exón específico se utiliza para examinar el patrón de corte y empalme de un exón alternativo interno, la única isoforma de mRNA detectada por la sonda es la que contiene el exón, mientras que la isoforma de mRNA sin el exón no puede ser detectado. Así, el cálculo por ciento empalmado en valor (PSI) para el exón alternativo es complicado. Además, ISH fluorescente convencional a menudo combina ISH con inmunotinción, que reduce la eficiencia de la detección y la robustez. Por ejemplo, en un estudio que investigó la tensión inducida empalme isoform de la conmutación de la acetilcolinesterasa (AChE) mRNA, digoxigenina fue incorporado en la sonda ISH y detectado usando anticuerpo anti-digoxigenina. Alternativamente, la sonda marcada con biotina fue detectado por un conjugado de fosfatasa alcalina/estreptavidina y sustrato para fosfatasa alcalina¹⁰. Ni método utiliza cualquier estrategia de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Como resultado, es difícil detectar las transcripciones del mRNA que se expresan en niveles bajos. Por lo tanto, es necesario un sistema de análisis ISH más simple y más robusto para analizar patrones de expresión en situ.

BaseScope es un reciente desarrollo basado en la plataforma de RNAscope, una bien establecida y ampliamente utilizado sistema de ensayo ISH. Ambos sistemas de ensayo emplean una tecnología de amplificación específico del destino que aumenta la sensibilidad de detección^11,12. Lo que distingue una de la otra es la longitud de la secuencia de destino, que es tan corta como 50 nucleótidos para BaseScope y 300-1.000 nucleótidos de RNAscope. Por lo tanto, es posible sondas de diseño dirigidos a uniones exón-exón para detectar específico alternativo mRNA isoforms. En el presente estudio, se estableció un procedimiento para examinar como patrones de expresión de la neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) exón 23a, un exón alternativo estudiado en el mismo laboratorio^{13,14,15 , 16 , 17}, en secciones de cerebro de ratón. Los resultados demuestran que el BaseScope es un sistema ideal para el estudio de patrones de expresión de Nf1 exón 23a in situ. Como este sistema de análisis puede ser adaptado para analizar como patrones de expresión de muchos exones alternativos, representa una poderosa nueva herramienta en los estudios de AS.