In Vivo Sonde di microdialysis metodo di raccogliere grandi proteine extracellulari dal cervello liquido interstiziale con cut-off di alto peso molecolare
Summary
Microdialisi in vivo ha permesso la raccolta di molecole presenti nel fluido interstiziale cerebrale (ISF) da animali svegli, comportarsi liberamente. Al fine di analizzare molecole relativamente grandi in ISF, l’attuale articolo si concentra in particolare sul protocollo microdialysis utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliata le membrane.
Abstract
Microdialisi in vivo sono una tecnica potente per raccogliere ISF da animali svegli, comportarsi liberamente basati su un principio di dialisi. Mentre microdialisi sono un metodo collaudato che misura relativamente piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori, è stato recentemente utilizzato per valutare anche dinamiche di più grandi molecole in ISF utilizzando sonde ad alto peso molecolare, tagliato fuori membrane. Al momento utilizzando tali sonde, microdialisi deve essere eseguito in una modalità push-pull per evitare pressione accumulata all’interno delle sonde. Questo articolo fornisce dettagliate protocolli tra cui chirurgia stereotassica e come impostare linee di microdialysis per raccogliere proteine da ISF. Durante microdialisi, i farmaci possono essere somministrati sistemica o mediante infusione diretta in ISF. Microdialisi inversa sono una tecnica per infondere direttamente composti in ISF. L’inclusione di farmaci nel buffer di aspersione di microdialysis permette loro di diffondere in ISF attraverso le sonde mentre simultaneamente raccolta ISF. Misurando la proteina tau come un esempio, l’autore Mostra come i suoi livelli sono alterati all’attività di stimolazione di un neurone di microdialysis inverso di picrotoxin. Vantaggi e limiti di microdialysis sono descritte con l’applicazione estesa combinando altri metodi in vivo .
Introduction
ISF comprende 15-20% del volume totale del cervello e offre un microambiente critico per la trasduzione del segnale, il substrato trasporto e sdoganamento dei rifiuti1. Quindi, la capacità di raccolta ISF da animali viventi fornirà maggiori implicazioni per vari processi biologici come pure il meccanismo di malattia. Microdialisi in vivo sono uno dei pochi metodi quel campione e quantificare molecole extracellulari da ISF da sveglio, animali liberi di muoversi e servono quindi come uno strumento utile nel campo di ricerca neuroscienze2,3. In questo metodo, sonde di microdialisi con membrane semipermeabili sono inseriti nel cervello e irrorati con buffer di perfusione alla portata relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante la perfusione, molecole extracellulari in ISF passivamente diffondono la sonda secondo il gradiente di concentrazione e raccolgono un dializzato. Sebbene questo articolo si concentra sul metodo a campione ISF nel cervello, sia il principio che il metodo può essere applicati ad altri organi di modifica appropriata se necessario.
Microdialisi in primo luogo è stato impiegato nel 1960 e da allora è stato ampiamente utilizzato per raccogliere piccole molecole, tra cui gli aminoacidi o neurotrasmettitori nel cervello. Tuttavia, recenti disponibilità commerciale di microdialysis sonde con alto peso molecolare tagliato membrane (100 kDa-3 MDa) ha esteso la sua applicazione alle proteine relativamente più grandi in ISF come pure4,5,6 ,7. Gli studi utilizzando queste sonde ha portato all’individuazione quello proteine tau o α-synuclein che a lungo sono stati pensati per essere esclusivo citoplasmico presentano anche come fisiologicamente in ISF4,5,8.
Una delle difficoltà usando le sonde microdialisi con grande tagliata membrane (in genere oltre 1.000 kDa) è che sono più suscettibili alla perdita di liquidi dovuta alla pressione interna accumulata nelle sonde ultrafiltrazione. Microdialisi sonde utilizzate qui hanno una struttura unica per evitare questo problema. La pressione non sarà costruita a causa di questa struttura, così microdialisi con queste sonde devono essere operati in modalità “push-pull” utilizzando una pompa a siringa per irrorare le sonde (= push) e una pompa a rulli/peristaltica per raccogliere la venuta del dializzato dalla presa sonda (= pull) 9 (anche se ha bisogno di pompe sia push e pull, a causa della pressione annullando i fori di sfiato presenti le sonde, il sistema è tecnicamente solo guidato dalla pompa pull). Questo articolo inizia con la chirurgia stereotassica di un impianto di cannula guida e viene descritto come impostare le linee di microdialysis al fine di raccogliere ISF tramite sonde di microdialisi con 1.000 membrane di cut-off di kDa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialisi con alto peso molecolare, tagliata le membrane deve essere operati da una modalità push-pull, pertanto è fondamentale che la portata è accurata e costante. L’imprecisione nei tassi di flusso può essere la causa della generazione di bolla di aria e incoerenza nella concentrazione del campione. Se il flusso è incoerente, controllare tutti i collegamenti per perdite. Se il problema persiste, potrebbe essere necessario ri-iniziare con tubi e nuove sonde.
Microdilaysis sonde sono …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da cm sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (cervello proteina invecchiamento e demenza Control)(15H01552) dal MEXT e sovvenzione per giovani scienziati (B) (16K 20969). L’autore ringrazia il Dr. David M. Holtzman e Dr. John R. Cirrito per i consigli tecnici durante lo sviluppo di questo metodo.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
Referencias
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