В естественных условиях Микродиализом метод для сбора крупных внеклеточных белков от мозга межклеточной жидкости с высокой молекулярный вес отсечения зонды
Summary
В естественных условиях микродиализом позволило коллекции молекул присутствует в межклеточной жидкости мозга (ISF) от бодрствования, свободно поведение животных. Чтобы проанализировать относительно больших молекул в СВБ, текущей статьи специально посвящен микродиализом протокол, с помощью зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны.
Abstract
В естественных условиях микродиализом является мощным средством для сбора ISF awake, свободно себя животных, основанную на принципе диализа. В то время как микродиализом является установленным методом, который меры относительно малых молекул, включая аминокислоты или нейротрансмиттеров, он был недавно использован также оценить динамику больших молекул в СВБ, с использованием зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны. При использовании таких зондов, микродиализом должен быть запущен в режиме push-pull чтобы избежать давления, накопленных внутри зондов. Эта статья содержит пошаговые протоколов, включая стереотаксической хирургии и как настроить микродиализом линии для сбора белки от ИФС. Во время микродиализом препараты могут администрироваться системно или путем прямого вливания в СВБ. Обратный микродиализом является методика сразу влить соединений в СВБ. Включение наркотиков в буфере перфузии микродиализом позволяет им диффундируют в СВБ через датчики одновременно собирая ИФС. Путем измерения тау-белка в качестве примера, автор показывает, как изменяются уровни его на стимулирование активности нейронов путем обратного микродиализом picrotoxin. Преимущества и ограничения микродиализом описаны наряду с расширенной приложений, объединяя другие методы в естественных условиях .
Introduction
МСФ состоит из 15-20% от объема всего мозга и предлагает микроокружения важна для передачи сигнала, субстрат транспорта и отходов Распродажа1. Таким образом способность собирать ISF от живых животных будет предоставлять больше последствия для различных биологических процессов, а также механизм заболевания. В естественных условиях микродиализом является одним из немногих методов, что образец и количественно внеклеточного молекул из СВБ от бодрствования, свободно перемещающихся животных и тем самым служит полезным инструментом в неврологии исследований поле2,3. В этом методе, микродиализом зонды с полупроницаемой мембраны вставляются в головном мозге и увлажненную с буфером перфузии на сравнительно медленный поток (0.1-5 мкл/мин). Во время этой перфузии внеклеточная молекул в СВБ пассивно диффундируют в зонд по градиенту концентрации и собирать в диализате. Хотя эта статья фокусируется на метод выборки ISF в головном мозге, принцип и метод может применяться для других органов соответствующие изменения при необходимости.
Микродиализом был впервые применен в начале 1960-х и с тех пор то он был широко использован для сбора мелких молекул, включая аминокислоты или нейротрансмиттеров в мозге. Однако недавние коммерческой доступности микродиализом зондов с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны (100 кДа-3 MDa) расширила его применение к сравнительно крупных белков в МФС также4,5,6 ,7. Исследования, используя эти зонды привела к поиску что белки как Тау или α-synuclein, которые давно считались исключительной цитоплазматических присутствуют также физиологически в СВБ4,5,8.
Одна из трудностей, с использованием зондов микродиализом с большими отрезать мембраны (обычно более 1000 кДа) является, что они более чувствительны к ультрафильтрации потери жидкости из-за внутреннего давления, накопленных в зондов. Микродиализом зонды, используемый здесь имеют уникальную структуру, чтобы избежать этой проблемы. Давление будет не создана из-за этой структуры, таким образом микродиализом с этих датчиков должны эксплуатироваться в режиме «push-pull» с помощью шприцевый насос для perfuse зонды (= push) и ролик/Перистальтический насос для сбора диализате приходить от розетки зонд (= по запросу) 9 (хотя он должен толкать и тянуть насосы, из-за давления, отмена вентиляционные отверстия в зонды, система технически только управляется тянуть насос). Эта статья начинается с Стереотаксическая операция имплантации канюля руководство и описывает, как настроить микродиализом линии для того, чтобы собирать ISF через микродиализом зонды с 1000 кДа отсечения мембраны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микродиализом с высокой молекулярной массой, отрезать мембраны должна управляться режим push-pull, таким образом очень важно, что скорость потока является точной и постоянной. Неточность в скорости потока может быть причиной воздушного пузыря поколения и непоследовательность в концентра…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ” целевые субсидии для проведения научных исследований в инновационных областях (старение мозга белка и деменция Control)(15H01552) от МПКСНТ и субсидий для молодых ученых (B) (16K 20969). Автор благодарит д-р Дэвид м. Хольцмана и д-р Джон р. Cirrito за технические советы в ходе разработки этого метода.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
Referencias
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
