في فيفو يسبر ميكرودياليسيس طريقة لتجميع البروتينات خارج الخلية كبيرة من الدماغ السائل الخلالي مع الوزن الجزيئي عالية وقف إنتاج المواد الانشطارية
Summary
وقد مكن في فيفو ميكرودياليسيس مجموعة من الجزيئات الموجودة في الدماغ السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية. من أجل تحليل الجزيئات الكبيرة نسبيا في قوي الأمن الداخلي، المادة الحالية يركز تحديداً على البروتوكول ميكرودياليسيس باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية.
Abstract
في فيفو ميكرودياليسيس تقنية قوية لتجميع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية استناداً إلى مبدأ الغسيل الكلوي. أن ميكرودياليسيس أسلوب المنشأة أن التدابير جزيئات صغيرة نسبيا بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية، فقد استخدم مؤخرا أيضا تقييم ديناميات الجزيئات الكبيرة في قوي الأمن الداخلي باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية. عند استخدام مثل هذه التحقيقات، وقد ميكرودياليسيس ليتم تشغيلها في وضع دفع وجذب لتجنب الضغوط التي تراكمت داخل التحقيقات. توفر هذه المقالة خطوة بخطوة البروتوكولات بما في ذلك الجراحة ستيريوتاكسيك وكيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس لتجميع البروتينات من قوي الأمن الداخلي. أثناء ميكرودياليسيس، يمكن إدارة الأدوية النظامية أو عن طريق التسريب المباشر إلى قوي الأمن الداخلي. وميكرودياليسيس عكس أسلوب لبث المركبات مباشرة إلى قوي الأمن الداخلي. إدراج العقاقير في المخزن المؤقت لنضح ميكرودياليسيس يسمح لهم منتشر في قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات حين جمع قوي الأمن الداخلي في وقت واحد. ويبين المؤلف بقياس البروتين تاو كمثال، كيف تتغير مستوياته على حفز نشاط الخلايا العصبية بعكس ميكرودياليسيس من بيكروتوكسين. يرد وصف المزايا والقيود المفروضة على ميكرودياليسيس جنبا إلى جنب مع التطبيق الموسع عن طريق الجمع بين أساليب أخرى في فيفو .
Introduction
قوي الأمن الداخلي تضم 15-20% حجم الدماغ الإجمالي ويوفر المكروية حاسمة بالنسبة لتوصيل الإشارة والنقل الركيزة وإزالة النفايات1. ولذلك، سيوفر قدرة جمع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات الحية آثار أكبر بالنسبة لمختلف العمليات البيولوجية، فضلا عن إليه المرض. في فيفو ميكرودياليسيس هي واحدة من الطرق القليلة أن العينة وقياس الجزيئات خارج الخلية من قوي الأمن الداخلي من مستيقظا، تتحرك بحرية الحيوانات ومما يخدم كأداة مفيدة في علم الأعصاب البحوث الميدانية2،3. في هذا الأسلوب، وإدراجها في الدماغ ميكرودياليسيس تحقيقات مع الأغشية semipermeable و perfused مع المخزن المؤقت التروية بمعدل التدفق البطيء نسبيا (0.1-5 ميليلتر/دقيقة). خلال هذه التروية، جزيئات خارج الخلية في قوي الأمن الداخلي منتشر في التحقيق وفقا للتدرج تركيز سلبية وجمع دياليساتي. على الرغم من أن تركز هذه المقالة على أسلوب الذي عينة قوي الأمن الداخلي في الدماغ، المبدأ والطريقة يمكن تطبيقها على الأجهزة الأخرى بالتعديل المناسبة إذا لزم الأمر.
واستخدمت ميكرودياليسيس أول مرة في أوائل الستينات، ومنذ ثم أنها قد استخدمت على نطاق واسع لجمع جزيئات صغيرة بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية في الدماغ. ومع ذلك، وسعت الأخيرة التوافر التجاري لتحقيقات ميكرودياليسيس مع الوزن الجزيئي العالية قطع الأغشية (100 3 كاتشين MDa) تطبيقه على البروتينات أكبر نسبيا في قوي الأمن الداخلي، وكذلك4،،من56 ،7. الدراسات التي تستخدم هذه المجسات أدى إلى إيجاد تلك البروتينات مثل تاو أو α-سينوكلين الذي كان يعتقد منذ فترة طويلة أن تكون حصرية هيولى موجودة أيضا الناحية الفسيولوجية في قوي الأمن الداخلي4،،من58.
إحدى الصعوبات استخدام المسابير ميكرودياليسيس مع قطع كبيرة من الأغشية (كاتشين 1,000 عادة أكثر) أنهم أكثر عرضه ل ultrafiltration السوائل المفقودة بسبب الضغوط الداخلية المتراكمة في التحقيقات. وقد ميكرودياليسيس المسابر المستخدمة هنا بنية فريدة من نوعها لتجنب هذه المشكلة. سوف لا تكون تراكمت الضغط نتيجة لهذا الهيكل، وبالتالي ينبغي أن يدار ميكرودياليسيس مع هذه التحقيقات في وضع “دفع وجذب” باستخدام مضخة الحقن إلى نتخلل المسابر (= دفع) ومضخة اسطوانة/تحوي جمع dialysate القادمة من منفذ مسبار (= السحب) 9 (على الرغم من أنه يحتاج إلى مضخات الدفع والجذب، بسبب ضغط إلغاء تنفيس ثقوب موجودة في التحقيقات، النظام من الناحية الفنية فقط تحركها مضخة سحب). يبدأ بالجراحة ستيريوتاكسيك لغرس القنية دليل هذه المادة وتوضح هذه المقالة كيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس من أجل جمع قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات ميكرودياليسيس مع كاتشين 1,000 وقف إنتاج الأغشية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ميكرودياليسيس مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية ليدار بطريقة دفع وجذب، وبالتالي من الأهمية بمكان أن معدل التدفق دقيقة وثابتة. عدم دقة في معدلات التدفق يمكن أن تكون قضية توليد فقاعة هواء وعدم تناسق في تركيز العينة. إذا كان التدفق غير متناسقة، تحقق من كافة الاتصالات للتسرب. إذا استمرت الم…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل ” معونات “البحث العلمي” في “مجالات مبتكرة” (بروتين الدماغ الشيخوخة والخرف Control)(15H01552) من يأمرون ومعونات للعلماء الشباب (ب) (20969 ك 16). شكرا مقدم البلاغ الدكتور ديفيد م. Holtzman والدكتور جون ر. سيريتو للنصائح التقنية أثناء تطوير هذا الأسلوب.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
Referencias
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
