校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ
Summary
非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ 9-ヌクレオチドより短いを証明しました。
Abstract
ゲノムとその忠実なレプリケーションのメンテナンスは、遺伝情報を節約するため重要です。忠実度の高いレプリケーションを評価するには、ラジオ-同位体比を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法 (MS) 分析校正に関すると単純な非標識を開発しました。ここでは、DNA ポリメラーゼ [例えばエシェリヒア属大腸菌DNA ポリメラーゼの Klenow のフラグメント (KF) 私 (ポル私) 本研究で] すべての 4 dideoxyribonucleotide 三リン酸塩の存在下で不一致プライマー テンプレート二重の処理に使用します。不一致のプライマーは校正/拡張し、MALDI-TOF MS を受けます。製品は、単一のヌクレオチドのバリエーションにプライマーの質量の変化によって区別されます。重要なは、校正も決定できます内部単一不一致の異なる効率ではあります。3′ 末端から 2-4-ヌクレオチド (nt) にある不一致が効率的に、pol で校正し、5 での不一致のプライマーの末端から nt を示した部分の補正のみ。プライマー 3′ 末端から 6-9 nt にある内部不一致のため校正なかった。このメソッドは、DNA 修復アッセイ (例えば遠藤 V 修復経路のための基板のベース病巣修復の評価) にも適用できます。3′ 終わりから二番目 deoxyinosine (dI) 病変を含むプライマーは、pol によって正されるかもしれない私。確かに、最後から二番目の T-私は、G-、私と -私基板があった最後の 2 ・ ディ ・含むヌクレオチド切除 pol で私、正しい ddN 5′-モノリン酸 (ddNMP) を追加する前に最後から二番目の C 中-私の不一致はポルで容認されたなし拡張するプライマーをできるように私修復、DNA 修復を測定するアッセイの感度と MS の分解能を発揮します。
Introduction
DNA の複製の時に DNA ポリメラーゼの校正関数子孫1,2,3,4に転送する必要があります遺伝情報の高忠実性を確保するために不可欠です。 5,6,7。Exonucleases の校正のポリメラーゼの貢献を評価することができるという遺伝的安定性の保護メカニズムを明らかにするでしょう。
放射性同位元素標識と autoradiograms または蛍光イメージング8,9,10のデンシトメトリーの分析と組み合わせてゲルに基づく試金 DNA の校正活動を検出する使用されている伝統的ポリメラーゼ。中機能、これらの試金は骨の折れる、高価、高スループットの形式に従わないです。さらに、放射性廃棄物処理を含む安全上の問題に苦しみます。また、蛍光法による校正活動を分析されています。などによる 2-アミノプリン (2 AP) は体外ポリメラーゼ蛍光信号11,12を生成するアッセイを校正中に拡張製品に組み込むことができます。残念ながら、2 AP はシトシンとチミンとペアすることができますので、これらのアプローチは低特異性と苦しみます。最近のアプローチにはいくつかを克服してアッセイを校正のポリメラーゼのため単独でラベルの蛍光プローブと同様に、3′-5′ エキソヌクレアーゼ アッセイ13敏感 G ベースから発光スイッチにプローブ ポリメラーゼにはが含まれます、前述の欠点の14。Dna の特定の分類のため必要があるのためこれらの蛍光メソッドのための熱意は低下します。
対照的に、DNA 解析の MALDI-TOF MS は、PinPoint アッセイ、ラベルのない 4 ddNTPs のプライマー拡張反応を与えられた軌跡15,16,17遺伝子多型を識別するために使用できますで採用されている、突然変異の検出の臨床アプリケーションで採用されているがん診断18。これらの基本原則を使用して、我々 は校正活動の高解像度、高い特異性と MALDI-TOF さんを利用した大腸菌の高スループット能力を悪用する DNA ポリメラーゼの体外定量ラベル無料アッセイを作成しています。大腸菌基板は、単一のヌクレオチドの拡張を介してMALDI-TOF MS (図 1) 後製品を校正の「スナップショット」取ることができるモデルの酵素、dideoxyribonucleotide 三リン酸塩 (ddNTPs) として私 Klenow の断片 DNA ポリメラーゼ。
同様に、この法を開発した DNA 修復アッセイを含む 3′ 終わりから二番目・ ディ ・病変が修復 pol にさらされるプライマーがどの模倣遠藤 V 傷修復中間体を分析します。完全には理解されて、遠藤 V 修復経路は病変切除19,20の exonuclease の作業を校正私 pol を採用する知られている唯一の修復システムです。MALDI-TOF MS を使用するを示す明確に定義された修復パッチによってポル ・ ディを摘出することができます私は、最後の 2 で発生した場合正しい補完ヌクレオチドを追加する前にプライマーの nt。
校正と DNA 修復の研究のため、このメソッドは、高速で、従来よりも少ない骨の折れる、メカニズムと機能に対する追加情報を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究は商業の選ばれた器械を用いてステップバイ ステップ校正活性を説明 (材料の表を参照してください) MALDI-TOF MS を使用しています。主要な利点がありますプライマーとテンプレートが無料で簡単に行うには、ラベルである実験の設計の柔軟性を可能にします。ストリーム-石灰 30 校正テストの処理は、校正の反応を手動で実行するため 3 時間を含む 4 時間を取るだろうし、…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
機能ゲノム学 (台湾台北) とテクニカル サポートのための NRPB ファーマコゲノミクス研究室 (台湾)、NCFPB 統合中核施設に感謝しますこの作品は、台湾健康財団 (L ロス) と省科学技術、台北、台湾、中華民国 [最も 105-2320-B-002-047] 魏八尾胡錦濤に対してからの研究補助金によって支えられた [最も 105-2628-B-002-051-MY3] – カンイー Su と [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 梁でリンの。
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Referencias
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