Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse
Summary
Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.
Abstract
De handhaving van het genoom en de trouwe replicatie is essentieel voor het behoud van de genetische informatie. Om te beoordelen HiFi replicatie, hebben we een eenvoudige niet-gelabeld en niet-radio-isotopische methode met behulp van een laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie met time-of-flight (MALDI-TOF) massa spectrometrie (MS) analyse voor een proeflezen studie. Hier, een polymerase van DNA [bijvoorbeeld het Klenow fragment (KF) van de polymerase van DNA van Escherichia coli ik (pol ik) in deze studie] in het bijzijn van alle vier dideoxyribonucleotide trifosfaat is gebruikt voor het verwerken van een niet-overeenkomende primer-template-duplex. De niet-overeenkomende primer is vervolgens proeflezen en verruimde en onderworpen aan de MALDI-TOF MS. De producten worden gekenmerkt door de massale verandering van de primer tot één nucleotide variaties. Nog belangrijker is, kan een proeflezen ook worden bepaald voor interne enkele problemen, zij het op verschillende efficiëntie. Gelegen op 2-4-nucleotiden (nt) van de 3′-eind incongruenties werden efficiënt Review door pol ik, en een mismatch op 5 nt van het eindstation van primer bleek slechts een gedeeltelijke correctie. Voor interne incongruenties gelegen op 6-9 nt vanaf de primer 3′ einde plaatsvond geen proeflezen. Deze methode kan ook worden toegepast op DNA testen (bijvoorbeeld, beoordeling van de reparatie van een base-laesie van substraten voor de endo V reparatie pathway) reparatie. Inleidingen met 3′ voorlaatste deoxyinosine (dI) laesies kunnen worden gecorrigeerd door pol ik. Inderdaad, voorlaatste T-ik, G-I, en A-ik substraten had hun laatste 2 dI-bevattende nucleotiden weggesneden door pol ik alvorens een juiste ddN 5′-monofosfaat (ddNMP) toe te voegen terwijl voorlaatste C-ik incongruenties werden getolereerd door pol I, waardoor de primer worden uitgebreid zonder herstellen, demonstreren dat de gevoeligheid en de resolutie van de MS assay voor het meten van de DNA-herstel.
Introduction
De proeflezen functies van de polymerase van DNA tijdens de DNA-replicatie zijn van essentieel belang om ervoor te zorgen de hifi van genetische informatie die moet worden overgedragen aan nakomelingen1,2,3,4, 5,6,7. Zijnde kundig voor het beoordelen van de bijdragen van polymerase proeflezen van exonucleases zou het verduidelijken van de mechanismen om genetische stabiliteit te waarborgen.
Isotoop labeling en gel gebaseerde testen in combinatie met densitometric analyses van autoradiograms of fosfor imaging8,9,10 zijn traditioneel gebruikt voor het detecteren van proeflezen activiteit van DNA polymerase. Hoewel functioneel, zijn deze tests arbeidsintensief, duur en niet vatbaar voor high-throughput formaten. Daarnaast lijden de radio-isotopen veiligheidskwesties met inbegrip van de verwijdering van afval. Anderzijds hebben proeflezen activiteiten zijn geanalyseerd door fluorimetrische technieken. 2-aminopurine (2-AP) kan bijvoorbeeld worden opgenomen in extensie producten tijdens in vitro polymerase proeflezen testen om te produceren een fluorescent signaal11,12. Helaas, deze benaderingen lijden onder een lage specificiteit, aangezien 2-AP met zowel thymine en cytosine koppelen kunt. Meer recente benaderingen omvatten een gevoelige G quadruplex-gebaseerde verlichte schakelaar-op sonde voor een polymerase van 3′ – 5′ exonuclease assay13 , alsmede een afzonderlijk-label fluorescente sonde voor een polymerase van proeflezen assay overwint enkele van de bovengenoemde nadelen14. Enthousiasme voor deze fluorimetrische methoden is verminderd als gevolg van de noodzaak van de specifieke etikettering van DNA substraten.
In tegenstelling, een MALDI-TOF MS voor DNA-analyse is werkzaam in de PinPoint-assay, waar de primer extensie reacties met labelloze 4 ddNTPs kunnen worden gebruikt voor het identificeren van polymorfismen bij een bepaald locus15,16,17 en grote schaal is goedgekeurd in klinische toepassingen voor mutatie detecties en kanker diagnoses18. Met behulp van deze fundamentele beginselen, hebben we een label-gratis test voor de bepaling in vitro van DNA-polymerase activiteit benutting van de hoge resolutie, hoge specificiteit en high-throughput potentieel van MALDI-TOF MS. gebruiken de E. proeflezen coli polymerase van DNA ik Klenow als een model-enzym, dideoxyribonucleotide trifosfaat (ddNTPs fragment) als substraten een “momentopname nemen kunnen” van proeflezen producten na een single nucleotide uitbreiding via MALDI-TOF MS (Figuur 1).
Ook werd deze methode ook ontwikkeld voor een DNA repair assay waar inleidingen met 3′ voorlaatste dI laesies zijn onderworpen aan een pol die ik herstellen assay welke nabootsers endo V gejat reparatie tussenproducten. Hoewel niet volledig begrepen, is de endo V reparatie traject het enige reparatie systeem bekend om de pol in dienst ik proeflezen exonucleaseactiviteit voor laesie excisie19,20. Met behulp van MALDI-TOF MS, laten we zien een duidelijk omschreven reparatie patch waar dI kan worden weggesneden door pol ik wanneer die zich voordoen in de laatste 2 nt van de primer voordat u toevoegt de juiste aangevuld nucleotide.
Voor de studie van proeflezen en DNA-herstel, deze methode is sneller en minder arbeidsintensief dan eerdere methoden en biedt extra informatie naar mechanisme en functie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie beschreven een stapsgewijze proeflezen activiteit assay geanalyseerd door de gekozen commerciële instrument (Zie de Tabel van materialen) met behulp van MALDI-TOF MS. De grote voordelen zijn dat de primer en de sjabloon label gratis en eenvoudig uit te voeren zijn, meer flexibiliteit bij het ontwerpen van experimenten. Een stream-kalk volledige verwerking van 30 proeflezen proeven zou duren 4 h, met inbegrip van 3 h voor het handmatig uitvoeren van de proeflezen reacties en hun opruimen, ter…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de NCFPB geïntegreerde Core faciliteit voor functionele genomica (Taipei, Taiwan) en de NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door onderzoekssubsidies van de Taiwan Health Foundation (L-I.L.) en het ministerie van wetenschap en technologie, Taipei, Taiwan, ROC [meest 105-2320-B-002-047] voor Wei-Yao Hu, [meest 105-2628-B-002-051-MY3] voor Kang-Yi Su en [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] voor Liang-In Lin.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Referencias
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Bioquímica. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
