تصحيح التجارب المطبعية ومقايسة إصلاح الحمض النووي باستخدام ملحق النوكليوتيدات واحدة واستخدام TOF تحليل الطيف الكتلي
Summary
وضع أسلوب غير المسمى، والنظائر المشعة في الراديو غير لتصحيح التجارب المطبعية بوليميراز الدنا ومقايسة إصلاح الحمض النووي استخدام الاستبانة TOF استخدام الطيف الكتلي واستراتيجية تمديد النوكليوتيدات واحدة. ثبت الفحص أن تكون محددة، وبسيطة، وسريعا جداً، وسهلة لإجراء لتصحيح التجارب المطبعية، وإصلاح بقع أقصر من 9-النيوكليوتيدات.
Abstract
صيانة الجينوم والنسخ المتماثل المؤمنين به أمر بالغ الأهمية للحفاظ على المعلومات الجينية. تقييم النسخ المتماثل عالية الدقة، قمنا بتطوير بسيط غير المسماة والنظائر المشعة في الراديو غير أسلوب استخدام تاين الامتزاز ليزر ساعد مصفوفة مع الوقت للطيران (استخدام-TOF) الشامل تحليل الطيف (مللي ثانية) لدراسة تصحيح التجارب المطبعية. هنا، بوليميراز الدنا [مثلاً الجزء كلينوو (KF) من الإشريكيّة القولونية دنا بوليميريز أنا (بول أنا) في هذه الدراسة] حضور جميع تريفوسفاتيس ديديوكسيريبونوكليوتيدي الأربعة يتم استخدامها لمعالجة الوجهين قالب التمهيدي غير متطابقة. هو ثم صحح/تمديد التمهيدي غير متطابقة وإخضاعها ل TOF استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد. المنتجات تتميز بالتغيير الشامل للتمهيدي وصولاً إلى الاختلافات النوكليوتيدات واحدة. الأهم من ذلك، تصحيح التجارب المطبعية يمكن أيضا تحديد لعدم التطابق واحد الداخلية، لو على الكفاءات المختلفة. عدم التطابق الموجود في 2-4-النيوكليوتيدات (nt) من نهاية 3 ‘ كانت كفاءة تدقيق ببول أنا، وعدم تطابق في 5 nt من المحطة التمهيدي أظهر تصحيح جزئي فقط. تصحيح التجارب المطبعية لا حدث لعدم التطابق الداخلية الواقعة في الإقليم الشمالي 6-9 من التمهيدي 3 ‘ نهاية. يمكن أيضا تطبيق هذا الأسلوب لفحوصات إصلاح الحمض النووي (مثلاً، تقييم إصلاح قاعدة الآفة من ركائز لمسار إصلاح إندو الخامس). يمكن تصحيح الإشعال تحتوي على 3 ‘ آفات ما قبل الأخيرة ديوكسيينوسيني (دي) عن طريق بول أنا. في الواقع، تي قبل الأخيرة-الأول، ز-الأول، و A-أنا ركائز كان الأخير 2 النيوكليوتيدات المحتوية على دي اقتطعت بول أنا قبل إضافتها الشبكة الداخلية صحيحة 5 ‘-الأدينوزين (دنمب) بينما ج قبل الأخيرة-أنا عدم التطابق قد تتغاضى عن بول الأول، يسمح الدليل التمهيدي تمديدها دون إصلاح، مما يدل على حساسية والقرار من مرض التصلب العصبي المتعدد الاعتداء على قياس إصلاح الحمض النووي.
Introduction
تصحيح التجارب المطبعية وظائف [بولمرس] الحمض النووي من خلال تكرار الحمض النووي ضرورية لضمان الدقة العالية للمعلومات الوراثية التي تحتاج إلى نقلها إلى ذرية1،2،،من34، 5،،من67. التمكن من تقييم إسهامات بوليميريز تصحيح التجارب المطبعية اكسونوكليسيس أن توضح آليات حماية الاستقرار الوراثي.
تصنيف النظائر المشعة وفحوصات على أساس جل في تركيبة مع التحليلات دينسيتوميتريك أوتوراديوجرامس أو الفوسفور التصوير8،،من910 تقليديا قد استخدمت للكشف عن النشاط تصحيح التجارب المطبعية للحمض النووي [بولمرس]. بينما الوظيفية، هذه فحوصات شاقة ومكلفة وغير قابلة لتنسيقات الفائق. وبالإضافة إلى ذلك، تعاني النظائر المشعة مسائل السلامة، بما في ذلك التخلص من النفايات. وبدلاً من ذلك، أنشطة التدقيق قد تم تحليلها باستخدام تقنيات فلوروميتريك. على سبيل المثال، 2-أمينوبوريني (2-AP) يمكن إدراجها في منتجات ملحق أثناء بوليميراز في المختبر على تصحيح التجارب المطبعية فحوصات لإنتاج إشارة فلورسنت11،12. لسوء الحظ، تعاني هذه النهج نوعية منخفضة، منذ 2-AP يمكن إقران مع الثايمين والسيتوزين. تشمل نهج أكثر حداثة حساسة ز-كوادروبليكس-تعتمد الإنارة التبديل في تحقيق بوليميراز 3 ‘-5’ [ااكسونوكلس] مقايسة13 ، فضلا عن تحقيق فلورسنت المسمى منفردة بوليميريز تصحيح التجارب المطبعية المقايسة أن يتغلب على بعض 14من العيوب المذكورة آنفا. الحماس لهذه الأساليب فلوروميتريك يتناقص بسبب الحاجة إلى وسم معين من ركائز الحمض النووي.
على النقيض من ذلك، استخدام TOF “مرض التصلب العصبي المتعدد” لتحليل الحمض النووي قد استخدمت في التحليل تحديد، حيث يمكن استخدام ردود الفعل تمديد التمهيدي غير مسمى دنتبس 4 تحديد مجمع الأشكال المتعددة في موضع معين15،،من1617 و وقد اعتمدت على نطاق واسع في التطبيقات السريرية للطفرة المكتشفة وتشخيص السرطان18. باستخدام هذه المبادئ الأساسية، وقد أنشأنا مقايسة خالية من التسمية للبت في المختبر بوليميراز الدنا تصحيح التجارب المطبعية نشاط استغلال عالية الدقة، وخصوصية عالية، وإمكانات الفائق للسيدة TOF استخدام استخدام هاء القولونية بوليميراز الدنا أنا كلينوو تجزئتها إنزيم نموذج، ديديوكسيريبونوكليوتيدي تريفوسفاتيس (ddNTPs) كما يمكن أن تتخذ ركائز “لقطة” لتصحيح التجارب المطبعية المنتجات بعد النوكليوتيدات واحدة ملحق عن طريق استخدام TOF MS (الشكل 1).
وبالمثل، هذا الأسلوب أيضا نمواً مقايسة إصلاح الحمض النووي حيث تحتوي على 3 ‘ الآفات دي قبل الأخيرة تتعرض لبول يمكنني إصلاح أجهزة الإشعال الاعتداء الذي يقلد إندو الخامس رصدت إصلاح وسيطة. بينما غير مفهومة تماما، مسار إصلاح إندو الخامس هو نظام إصلاح الوحيد المعروف لتوظيف pol أنا تصحيح التجارب المطبعية [ااكسونوكلس] نشاط للآفة الختان19،20. استخدام MS استخدام TOF، علينا إظهار تصحيح إصلاح محددة بوضوح حيث يمكن أن اقتطعت بول دي أنا عندما تحدث في الماضي 2 nt الدليل التمهيدي قبل إضافة النوكليوتيدات تستكمل الصحيح.
للدراسة لتصحيح التجارب المطبعية وإصلاح الحمض النووي، هذا الأسلوب أسرع وأقل مشقة من الأساليب السابقة ويوفر معلومات إضافية صوب إليه ودالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ووصف هذه الدراسة تحليل نشاط تصحيح التجارب المطبعية خطوة بخطوة تحليلها بواسطة الأداة التجارية المختارة (انظر الجدول للمواد) باستخدام MS استخدام TOF. وتشمل المزايا الرئيسية أن التمهيدي والقالب هي التسمية مجانية وسهلة لإجراء، مما يسمح بمزيد من المرونة في تصميم التجارب. تيار جير كامل …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “مرفق الأساسية المتكاملة نكفبب” للجينوم الوظيفي (تايبيه، تايوان) ومختبر مواضيعها NRPB (تايبيه، تايوان) لتقديم الدعم التقني لهم. هذا العمل كان يدعمها منحا بحثية من مؤسسة الصحة تايوان (L-I.L.) ووزارة العلوم والتكنولوجيا، تايبيه، تايوان، جمهورية الصين [التي الأكثر 105-2320-ب-002-047] “هو جين تاو” ياو وي، [الأكثر 105-2628-ب-002-051-MY3] “سو” يي كانغ، و [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] للين ليانغ.
Materials
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
Referencias
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. . DNA replication. , (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Bioquímica. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3′-5′ proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3′ penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J., Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
