Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

B-lymfocyten zijn de belangrijkste speler in de Humorale immuniteit en het enige celtype in zoogdieren die produceren antilichamen kunnen, ook aangeduid als immunoglobulinen (Ig)^1,2. Antilichamen uitgescheiden door B-cellen zorgen voor een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen, met inbegrip van neutralisatie, opsonization en activering van de aanvulling, wat leidt tot protectieve immuniteit³. Secretie van antilichamen door B-cellen wordt alleen bereikt na volledige activering van bepaalde B-cellen, die normaal gesproken vereist dat twee verschillende signalen³. Signaal 1 doorgegeven door directe binding van het antigeen (Ag) naar de B-cel receptor (BHG) uitgedrukt op het oppervlak van specifieke naïef B cellen³. Afhankelijk van de bron van signaal 2, kan B-cel-activatie worden onderverdeeld in zwezerik-afhankelijke (TD) of zwezerik-onafhankelijke (TI)^3,4. In een reactie TD antigeen wordt signaal 2 verzorgd door geactiveerde cognaat CD4 T helper (T_H) cellen, die express CD154, de ligand voor de co-stimulatory receptor interactie CD40 uitgedrukt op B cellen^1,2,3. In een reactie TI antigeen signaal 2 komt uit beide betrokkenheid van Toll-like receptoren (TLRs in het geval van type 1 TI Ag) of uitgebreide cross-linking van de BCRs (in het geval van type 2 TI Ag) op de B cellen^3,4. Type 1 TI (TI-1) antigenen zijn microbiële liganden van TLRs, met inbegrip van bacteriële lipopolysacchariden (LPS), virale RNAs, en microbiële CpG DNA^4,5. Type 2 TI (TI-2) antigenen zeer repetitieve structuur hebben, en zijn in staat om langdurige en voortdurende signalering naar de B-cel door meerdere cross-linking van de BCRs^4,6. Typische voorbeelden van TI-2 antigenen zijn pneumokokken polysacchariden en hapten-geconjugeerde polysaccharide^6,7. Zowel TD en TI antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en kunnen ook leiden tot de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) met de hulp die geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs) zoals dendritische cellen (DC’s)^{1 ,2,3}. Bovendien zowel TD en TI antigenen kunnen ertoe geheugen reacties met behulp van APCs, maar TD antigenen zijn efficiënter in inducerende geheugen B-cel generatie^3,8.

In dit protocol zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen 2,4,6-trinitrophenyl-sleutelgat limpet hemocyanine (TNP-HC) en TNP-polysaccharide (neutraal, sterk vertakt en hoge-massa), respectievelijk^9,10,11. TD-antigenen zijn het meestal gebruikt met adjuvans ter verbetering van de productie van antilichamen¹². Hier in ons protocol, wordt TNP-HC geïnjecteerd met aluin, een veelgebruikte adjuvans in immunisatie studies¹². Andere voorbeelden van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt zijn volledig of onvolledig Freund van adjuvans (CFA- of IFA), monophosphoryl-lipide-A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adjuvans), en apr oligodeoxynucleotides, etc.^{13, 14}. na immunisatie, muis sera op verschillende tijdstippen worden geoogst en TNP-specifieke antistoffen in sera worden gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)^{9,10, 11}.

ELISA is een plaat gebaseerde test die wijd is gebruikt als kenmerkend hulpmiddel in geneeskunde en ook als een analytisch hulpmiddel in biomedisch onderzoek^15,16. Het wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de analyten met inbegrip van antilichamen, hormonen, cytokinen, chemokines, en verschillende antigenen, enz. ELISA kan worden uitgevoerd in verschillende indelingen, met inbegrip van directe, indirecte, sandwich en competitieve ELISA^15,16. In het algemeen, het gaat om de immobilisatie van het antigeen op een effen oppervlak, meestal een 96-wells microtiterplaat plaat, die is geïncubeerd met een primair antilichaam. Na incubatie is het unbound antilichaam weggewassen. In een directe ELISA, is het primaire antilichaam direct geconjugeerd met een enzym (meestal mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase), die een chromogenic substraat klieven kan om de opbrengst van een zichtbare kleurverandering gedetecteerd door een signaal-detectie-instrument, zoals een spectrofotometer^15,16. Daarentegen als een enzym-verbonden secundair antilichaam wordt gebruikt voor het binden van het primaire antilichaam, wordt dan dit beschouwd als een indirecte ELISA^15,16. Directe ELISA is sneller terwijl indirecte ELISA gevoeliger^{15,16 is}. De platen zijn bekleed met een “capture” antilichaam gebruikt om te immobiliseren van het antigeen van belang in de monsters in een sandwich-ELISA, en vervolgens het vastgelegde antigeen kan worden opgespoord door een andere “” detectieantilichaam in een directe of indirecte wijze^{15, 16}. Sandwich-ELISA biedt hoge specificiteit aangezien het antigeen wordt gedetecteerd door twee verschillende antilichamen van het antigeen. De competitie is gevestigd tussen de monster-antigeen en het plaat-gebonden antigeen voor de binding met het primaire antilichaam in een competitieve ELISA, en vervolgens de concentratie van antigeen in de steekproef wordt gekwantificeerd door het meten van de afname van het signaal van het substraat ^{15 , 16}. competitieve ELISA kan worden uitgevoerd met behulp van de hierboven genoemde directe of indirecte indeling en is nuttig voor het opsporen van kleine antigenen met slechts één epitoop^15,16.

Alternatieve technieken voor het meten van antilichamen omvatten radio-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) assay en oppervlak plasmon resonantie (SPR) assay¹⁷. RIA was de eerste immunoassay ontwikkeld dat maatregelen de aanwezigheid van een antigeen (of antilichaam) met hoge specificiteit en de gevoeligheid met behulp van radiolabeled reagentia^18,19. Echter, als gevolg van de bezorgdheid van radioactieve toxiciteit, verwijderingskosten, houdbaarheid en speciale licenties te werken met radioactieve materialen, ELISA is een betere en meer handige techniek voor common gebruikt^20,21. ECL is een hooggevoelige test waarin chemiluminescentie reacties worden gestart met behulp van elektriciteit te genereren zeer reactieve soorten uit stabiele precursoren op het oppervlak van een elektrode, en kunnen worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid analyten (zoals antigenen of antilichamen)²². Echter, ECL vereist een speciaal instrument en dus is niet zo breed gebruikt als ELISA²³. SPR is een directe test die kan worden gebruikt voor het meten van de binding van liganden (bv., antilichamen) aan geïmmobiliseerd moleculen (bv., antigenen) op een sensor chip oppervlakte²⁴. SPR detecteert de interacties in real-time heel concreet en vereist niet het gebruik van gelabelde reagentia zoals in ELISA. Echter, SPR ook vereist dat een speciale apparatuur en lagere gevoeligheid dan ELISA¹⁷heeft. Gezien de beperkingen van de alternatieve methoden, is ELISA de meest geschikte en handige techniek voor ons doel in dit protocol. Hier beschrijven we het gebruik van sandwich-ELISA voor de analyse van de totale Ig isotype-niveaus en de procedures van indirecte ELISA voor de analyse van antigeen-specifieke Ig isotypes.