レプリカの設定方法: 定量的測定線虫の寿命を高スループット方法
Summary
ここで述べるレプリカ セットのメソッド、定量的測定線虫の寿命/生存へのアプローチ、healthspan 高スループットかつ堅牢な方法でデータの品質を損なうことがなく多くの条件の審査をできるようにこのプロトコルは、戦略の詳細し、レプリカ セットのデータの解析のためのソフトウェア ツールを提供します。
Abstract
レプリカ セットのメソッドですので、同じ量をより多くの治療法や条件を画面に単一の調査官、高スループット方法で寿命や線虫寄生線虫の生存率を定量的測定の試み時間データの品質の損失なし。メソッドc. の elegansの使用ほとんどの実験室は、一般的な機器を必要とする、従って採用する簡単です。アプローチは、従来の縦断的方法として時間をかけて 1 つのサンプルではなく、各観測点での人口の独立したサンプルの試金に集中します。ウェル プレートの井戸への液体の追加が伴いますを得点、線虫の移動を刺激して healthspan で定量化の変更が容易になります。レプリカ セットのメソッドの他の主な利点は、寒天表面 (例えばカビや菌類)、空輸の汚染物の減らされた露出、動物と散発的なミス (それはまだ、死んだ動物の呼び出しなど得点に堅牢性の処理が最小限生きている)。適切に分析し、レプリカ セット スタイル実験からのデータを表示する、カスタムのソフトウェア ツールも開発されました。ソフトウェアの現在の機能は、レプリカ セットのレプリカ セットし伝統的な (カプラン-マイヤー) 実験と同様両方統計分析の生存曲線のプロットがあります。ここで提供されるプロトコルは、従来の実験的アプローチ、レプリカ セットのメソッドと対応するデータ解析の概要について説明します。
Introduction
高齢化の遺伝的基盤の理解に向けて最もトランスフォーマティブ技術の進歩の 1 つだった供給ベース RNAi線虫1の開発RNAi の実験的使用、する前に老化の多くの表現型は遺伝的扱いでした。RNAi の供給ベース、エシェリヒア属大腸菌の一致する内 dsRNA の生産によって達成される、内因性線虫mRNA: IPTG どちらかc. の elegansの cDNA を挿入またはの部分間で双方向の転写を誘導する、プラスミド2内で開いたリーディング ・ フレーム。C. の elegansをそのまま食らうとき細菌エシェリヒア属大腸菌、 dsRNA は内腔から SID 2 膜貫通型蛋白3、腸細胞に運ばれ、SID 14を介して動物の残りの部分を通して配布されます。各セル内外因性 dsRNA によって処理される複雑なダイサー、siRNA に新しいを作成する基本の相補的なペアリングを介して成熟した mRNA と関わりを持つ siRNA mRNA 二重。この二重が RISC の複合体によって認識され、切断され、それにより内在性 mRNA5を分解します。したがって、プラスミッド挿入を変更しただけ、線虫ゲノム内のほぼすべての遺伝子の機能を非アクティブ化することができます 1 つ。ライブラリ-コレクションの変換大腸菌株の約 86% のカバレッジを達成するために組み合わせることのできるいくつかの大規模な供給ベースの RNAi の作成をもたらしたこの発見にc. の elegans遺伝子6,が知られています。7。
我々 参照してくださいときに (WormBase のキュレーション RNAi 表現型の関連付けによって証明される) ように不活化、寿命を変える以上 900 の遺伝子の発見につながっている線虫の包括的なスクリーン供給ベースの RNAi の進歩により、以来gerogenes として。長寿コントロールの gerogenes の大半のための役割はちょうど少数の精液レポートでの RNAi の供給ベースを介して発見された (詳細については図 1Aと補足ファイル 1を参照)。いくつかの場合、これらの gerogenes は、RNAi 治療と寿命の変化の定量化が可能な測定を提供するために失敗する 1 つまたはいくつかの時点での生存率の測定に基づく同定されています。他のケースでこれらの遺伝子は寿命だけでなく、追加の加齢に伴う表現型の変化の定量的評価されている.例えば、我々 は以前通常と増加寿命減少インスリン/IGF-1 伝達を持つ動物のために必要な healthspan の変化を定量化 159 の遺伝子を識別しました。損失老化8の 1 つ以上の兆候として、これらの 103 の遺伝子不活 progeric 表現型の結果します。
いくつかの gerogenes は、100 以上の研究 (daf 16、daf 2、サー 2.1 など) と関連付けられている、以上 400 gerogenes 10 個以下の引用 (図 1 b、および補足のファイル 2) あります。したがって、包括的な供給ベース RNAi 画面が発見し、cursorily 推定 gerogenes の何百もの特徴、どのように寿命コントロールでこれらの遺伝子の機能とそれらの遺伝子産物の遺伝的相互関係まま悪い勉強しました。加齢に伴う表現型に対する完全縦断的分析 gerogenes (例えば間相互作用、asynthetic 相互作用など)の間の遺伝子相互作用を識別するための前提条件です。Gerogenes 間の遺伝的相互関係をより深く洞察を得ても RNAi の供給ベースの利点を活用して高スループットの量的な方法が必要です。
高齢化の最も一般的な代理メジャーは、寿命です。線虫 c. エレガンスの死亡率を測定するための従来のアプローチは、小さい人口サンプル内で時間をかけて個々 の動物の死を追跡します。動物の数が比較的少ない時間以上続いているし、定期的に白金線または生存率 (図 2 a) の指標として運動とまつげが猛烈優しく。このメソッドは簡単な直接測定の平均と最大の寿命を提供するので広く使用されています。しかし、この従来の方法は時間がかかり、比較的低スループット、動物および制御された方法で同時に測定できる条件の数を制限します。最近のシミュレーション研究が見つかりました多くの線虫の寿命の研究を行う条件9間の小さな変化を確実に検出できるように動物の十分に大きい数を分析していません。さらに、この従来の方法は、時系列、順番汚染をもたらすとすることができます破損したりますます壊れやすい、高齢の動物を殺す動物の同じコホートを繰り返し処理含まれます。
線虫の寿命を測定するための代替「Replica Set」手法を開発しました。このため、年齢同期、同質の動物の大規模な人口は小さい人口 (またはレプリカ) の数に分かれています。計画の実験の各時間のポイントをカバーする十分なレプリカ サンプルが生成されます。各観察時間時点でのレプリカのいずれかのリビングデッド、数のスコアは、修正動物、その複製の中で動物が破棄されます。したがって、独立した集団のシリーズ、全体として人口の期待寿命は、定期的にオーバー サンプリング (図 2 b) です。レプリカ セットの使用には動物や潜在的な環境汚染への繰り返された露出無しの繰り返し催促はありません。一時点で観測された生存率はすべて他の観察、処理を最小限に抑え、少なくとも桁違いでスループットが向上するから完全に独立。これは RNAi の何百もの同時に8,10クローンの寿命の変化量的に表わすことができました。
レプリカ セット、線虫の寿命をスコアリングのための伝統的な方法を介して線虫の寿命を実施するための詳細なプロトコルをご紹介します。方法と同様の結果が得られることを示す.我々 は自由に GPL V3 ライセンス (材料の表を参照) の下で提供するいずれかのアプローチを通じて生成された寿命データのグラフィカルな分析を支援するために開発されたソフトウェアがあります。”WormLife”は R11で書かれているし、Mac OS と Linux でテスト済みのデータのプロットのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) が含まれています。最後に、我々 は比較コントラストの各メソッドの制限、線虫の寿命の量的変化を測定するためのアプローチを選択する際の他の考慮事項を強調表示。
Protocol
Representative Results
Discussion
従来およびレプリカ セット メソッドでは、年代順に老化させた動物の同期必要があります。我々 は、妊娠の大人の受精卵のみが治療を生き残るため妊娠大人の次亜塩素酸処理を使用して動物を同期するメソッドを含めます。これらの胚は液体懸濁液で孵化し、幼生期 (L1) で逮捕発達。食糧 (例えば大腸菌発現に dsRNA 興味の遺伝子) に L1 動物, 播種後の動物は開発を再開します?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本稿で説明するこの作業によって提供された資金: ロチェスター大学事務所の学長、医学部と歯学研究科長のオフィスで健康科学センターの計算技術革新 (HSCCI);エリソン医療財団新しい学者エージング フェローシップ (AG-NS-0681-10) の資金提供者に役割研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備したないです。
Materials
| IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| Retangular non-treated single-well plate, 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| Air-permeable plate seal | VWR | 60941-086 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| bacto-peptone | VWR | 90000-368 | |
| bacteriological agar | Affymetrix/USB | 10906 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| WormLife- Software for Replica Set Survival Analysis | Samuelson Lab | N/A | https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
| Wormbase | http://www.wormbase.org/ | ||
| OASIS | https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ | ||
| Graphpad Prism | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Referencias
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