Manipulación de células vivas para construir estable montaje celular 3D sin andamio Artificial

1. preparación de las células Mantener NAMRU ratón glándula mamaria epiteliales células (NMuMG) con 5 mL de D-MEM con 10% (v) suero bovino fetal (FBS) y 1% (v) penicilina-estreptomicina (P/S) en un matraz de 25 cm3 . Quitar Dulbecco modificado medio del águila (D-MEM), que contiene 10% FBS y 1% P/S. Añadir 3-5 mL de solución salina de 37 ° C con tampón fosfato (PBS) (-) en el matraz. Tenga en cuenta que el pH de PBS es 7.1-7.3. Retirar el PBS del frasco utilizando un aspirador. Añadir 1,5 mL de tripsina de 37 ° C (0,25%, w/v) en el matraz. Incube el frasco de aproximadamente 1 a 2 minutos a 37 ° C en un incubador de CO2 . Añadir 3,5 mL de D-MEM con 10% FBS y 1% P/S al matraz. Pipeta para mezclar. Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar durante 3 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el radio de giro y velocidad de rotación de la centrífuga son 16,6 cm y 1500 rpm, respectivamente. Bajo esta condición, la fuerza centrífuga relativa es 417 x g. Añadir 5 mL de D-MEM fresco (10% FBS y 1% P/S) en el matraz después de aspirar el medio (si es necesario, criopreservar las células con solución de criopreservación, siguiendo las instrucciones del fabricante). 2. preparación de dextrano (DEX) Preparar 80 mg/mL de solución DEX mezclando 10 mL de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) y 0,8 g de DEX. Tenga en cuenta que la solución DEX se puede filtrar con un filtro de jeringa (0,22 μm) después de que las células han cultivado durante tiempo suficiente. Preparar una suspensión que contiene medio DEX 40 mg/mL mediante la mezcla de 200 μL de solución DEX y 200 μL de la suspensión preparada en el punto 2.1. Tenga en cuenta que la densidad del número de células en la solución es aproximadamente 2.3 × 105 células/mL. 3. preparación para el láser y la microscopía Encienda el láser (onda continua, longitud de onda de 1.064 nm) (figura 1a). Tenga en cuenta que el uso de un rayo láser con una longitud de onda en el rojo para la región del infrarrojo cercano es más eficaz; esta región de longitud de onda se llama la ventana diagnóstica y terapéutica10 ya que es mínimamente absorbida por las células. Haga doble clic en el icono del software. Haga doble clic en que los iconos de la cámara ①, ② de diódos de luz (LED), foco ③ ajustan y ④ etapa en movimiento. Se mostrará la pantalla correspondiente a ①-④ (figura 1b). 4. célula manipulación usando el sistema de captura de láser Lugar 20 μl de la muestra preparada en el paso 2.2 en el vidrio de la cubierta inferior (0,17 mm de espesor, tamaño = 30 x 40 mm) y cúbrala con el vidrio de cubierta superior (0,17 mm de espesor, tamaño = 18 x 18 mm), con separación de dos espaciadores (0,17 mm de espesor tamaño = 10 mm × 24 mm), como se muestra en la figura 2. Tenga en cuenta que estas gafas no requieren una capa especial. Colocar la celda de muestra preparada en el paso 4.1 en el objetivo inferior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 0,28 mm, abertura numérica = 1.2)). Fijar el objetivo superior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 2 mm, abertura numérica = 1.0) en la parte superior de la celda de muestra. Enciende el LED luz haciendo clic en el icono 2 (figura 1b). Ajustar la distancia entre la muestra y el objetivo inferior haciendo clic en los iconos en el panel 3 (figura 1b) hasta que esté en foco. Irradiar los rayos láser en posición 1 y posición 2 (figura 1B) de la muestra haciendo clic en los iconos I, II y III (figura 1b). Ajustar la intensidad de cada rayo láser a 1.500 mW introduciendo este valor en icono IV (figura 1b). Paso la etapa de muestra haciendo clic en las direcciones que indica icono 4 (figura 1b) hasta una célula está atrapada en la posición 1 (figura 1b). Arrastre el cursor que indica posición 2 (figura 1b) hasta otra célula está atrapado en la posición 2. 5. construcción de una estructura de 3 dimensiones (3D) celular Manipular una sola celda que está en contacto con otra célula. Mantener esta condición por 300 s; es decir, cada célula está expuesto a un láser de 300 s. Registrar el eje X que se muestra en la figura 1b. Captura y transporte de otra célula a las células para construir un conjunto celular 2D arbitraria. Construir un conjunto celular 3D moviendo arriba y abajo del escenario. Confirma que la Asamblea sigue siendo estable después de desconecta el láser.