Manipolazione delle cellule viventi per costruire assieme cellulare 3D stabile senza impalcatura artificiale

1. preparazione delle celle Mantenere cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo a NAMRU (cellule NMuMG) con 5 mL di D-MEM contenente 10% (v) siero bovino fetale (FBS) e 1% (v) penicillina-streptomicina (P/S) in un pallone di3 cm 25. Rimuovere Dulbecco per volta medio dell’Aquila (D-MEM), contenente 10% FBS e 1% P/S. Aggiungere 3-5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) (-) e 37 ° C al pallone. Si noti che il pH del PBS è 7.1-7.3. Rimuovere tutto il PBS dalla beuta utilizzando un aspiratore. Aggiungere 1,5 mL di tripsina di 37 ° C (0,25%, p/v) al pallone. Incubare la beuta per circa 1-2 minuti a 37 ° C in un incubatore a CO2 . Aggiungere 3,5 mL di D-MEM contenente 10% FBS e 1% P/S al pallone. Pipetta per mescolare. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare a esso per 3 min a temperatura ambiente. Notare che il raggio di rotazione e la velocità di rotazione della centrifuga sono 16,6 cm e 1500 giri/min, rispettivamente. In questa circostanza, la forza centrifuga relativa è 417 x g. Aggiungere 5 mL di fresco D-MEM (10% FBS e 1% P/S) al pallone dopo avere aspirato il mezzo (se necessario, crioconservare le cellule con soluzione di crioconservazione, seguendo le indicazioni del produttore). 2. preparazione di destrano (DEX) Preparare 80 mg/mL di soluzione DEX mescolando 10 mL di D-MEM (10% FBS, 1%P/S) e 0,8 g di DEX. Si noti che la soluzione DEX può essere filtrata con un filtro per siringa (0,22 µm) dopo che le cellule sono coltivate per un tempo sufficiente. Preparare una sospensione di cellule contenenti 40 mg/mL di terreno di DEX mescolando 200 µ l di soluzione DEX e 200 µ l di sospensione cellulare preparata al punto 2.1. Si noti che la densità di numero delle cellule nella soluzione è circa 2.3 × 105 cellule/mL. 3. preparazione per Laser e microscopia Accendere il laser (onda continua, 1.064 nm lunghezza d’onda) (Figura 1a). Si noti che l’uso di un fascio laser con una lunghezza d’onda nel colore rosso alla regione vicina all’infrarosso è più efficace; Questa regione di lunghezza d’onda si chiama finestra diagnostica e terapeutica10 poiché è minimamente assorbito dalle cellule. Fare doppio clic sull’icona del software. Fare doppio clic che le icone di fotocamera ① ② diodo luminoso (LED), messa a fuoco ③ per regolare, quindi ④ fase commovente. I display corrispondente ④ ① mostrerà (Figura 1b). 4. cell manipolazione utilizzando il sistema Laser Trapping Posto 20 µ l del campione preparato nel passaggio 2.2 il vetro di copertura inferiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 30 × 40 mm) e coprire con il vetro di copertura superiore (0,17 mm di spessore, dimensione = 18 × 18 mm), con separazione fornito da due distanziatori (0,17 mm di spessore dimensione = 10 mm × 24 mm), come illustrato nella Figura 2. Si noti che questi occhiali non necessitano di un rivestimento speciale. Posizionare la cella del campione preparata nel passaggio 4.1 sulla lente dell’obiettivo inferiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 0,28 mm, apertura numerica = 1,2)). Fissare l’obiettivo superiore (acqua immersione con ca. 10 μl, ingrandimento = 60 X, distanza di lavoro = 2 mm, apertura numerica = 1.0) nella parte superiore della cella del campione. Accendere il LED luce facendo clic sull’icona 2 (Figura 1b). Regolare la distanza tra il campione e la lente dell’obiettivo inferiore facendo clic sulle icone sul pannello 3 (Figura 1b) fino a quando non è a fuoco. Irradiare i raggi laser in posizione 1 e posizione 2 (Figura 1B) del campione cliccando le icone, I, II e III (Figura 1b). Impostare l’intensità di ogni fascio laser a 1.500 mW inserendo questo valore a icona IV (Figura 1b). Spostare la fase del campione facendo clic su indicazioni stradali indicando icona 4 (Figura 1b) fino a quando una cella viene intrappolata in posizione 1 (Figura 1b). Trascinare il cursore che indica la posizione 2 (Figura 1b) fino a un’altra cella viene intercettato in posizione 2. 5. costruzione di una struttura di cella 3-dimensionale (3D) Manipolare una singola cella in modo che sia a contatto con un’altra cella. Mantenere questa condizione per 300 s; cioè, ogni cella è esposta ad un laser per 300 s. Registrare l’asse di X-Y, mostrato nella Figura 1b. Costruire un assembly arbitrario cella 2D intrappolando e trasportando un’altra cella per le celle. Costruire un assembly cellulare 3D spostando su e giù il palco. Confermare che l’assembly rimane stabile dopo il laser viene spento.