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Bioingeniería

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57803
, ,
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy,University of Gothenburg

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die stammvenen Decellularization mit Wasch- und Recellularization durch die Durchblutung der peripheren Blut und die endotheliale Medium.

Abstract

Vaskuläre Conduits verwendet, während die meisten vaskuläre Operationen sind allogene oder synthetische Transplantate, die oft zu Komplikationen, die durch Immunsuppression und schlechte Durchgängigkeit führen. Gewebe-Engineering bietet eine neuartige Lösung um personalisierte Transplantate mit einer natürlichen extrazellulären Matrix des Empfängers Zellen mit der Methode der Decellularization und Recellularization zu generieren. Wir zeigen eine detaillierte Methode für die Durchführung von Decellularization der menschlichen stammvenen und Recellularization durch Perfusion des peripheren Blutes. Die Vene war decellularized Vorrichtung 1 % Triton x-100, 1 % Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Deoxyribonuclease (DNase) 2.000 Kunitz Maßeinheiten. Triton x-100 und TnBP wurden bei 35 mL/min für 4 h durchströmt, während DNase bei 10 mL/min bei 37 ° C für 4 h durchströmt wurde. Die Vene war in Reinstwasser und PBS gewaschen und dann in 0,1 % Peressigsäure sterilisiert. Es war wieder mit PBS-Puffer gewaschen und in Endothelzellen Medium vorkonditioniert. Die Vene war verbunden mit einem Bioreaktor und durchblutet mit endothelialen Medium mit 50 IU/mL Heparin für 1 h Recellularization erfolgte durch Füllung der Bioreaktor mit frischem Blut, 1:1 in Steen Lösung verdünnt und endokrine Drüse abgeleitet vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren (80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL). Der Bioreaktor wurde dann zog in einem Inkubator und durchblutet für 48 h mit 2 mL/min unter Beibehaltung Glukose zwischen 3-9 Mmol/L. Später wurde die Vene mit PBS gewaschen, mit endothelialen Medium gefüllt und für 96 h im Inkubator durchblutet. Behandlung mit Triton x-100, TnBP und DNase decellularized die stammvenen in 5 Zyklen. Die decellularized Vene sah weiß im Gegensatz zu normalen und recellularized Venen (hellrot). Das Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung zeigte die Anwesenheit von Kernen nur in Normal, aber nicht in decellularized Adern. In der recellularized Vene zeigte H & E Färbung die Anwesenheit von Zellen auf der luminalen Oberfläche der Vene.

Introduction

Vaskuläre Leitungen sind für verschiedene Krankheitsbilder wie Aneurysmen, Arteria carotis-Stenose und Arteriosklerose führt zu schweren vaskulären Problemen erforderlich. Chirurgen verwenden autologen, allogenen oder synthetische vaskulären Conduits, die funktionelle Blutversorgung wiederherzustellen. Obwohl die Verwendung von autologen Blutgefäße noch den idealen Ansatz gilt, ist die Verfügbarkeit bei Patienten majorly eingeschränkt. Die Alternativen wie synthetische oder allogene Transplantate haben tiefgreifende Probleme mit immunsuppressiven Behandlungen und schlechte Durchgängigkeit Reoperation1,2, was zu großen gesundheitlichen Belastungen in Länder führt. Gewebe-Engineering von Blutgefäßen soll Transplantate bieten eine natürliche Homologie und autologen Zellen. Damit der Empfänger Immunsystem erkennt die transplantierten Transplantat als das selbst und da solch eine Transplantat die natürlichen Proteinen und Zellen in der ursprünglichen Konfiguration enthält, könnte es besser funktionieren, im Vergleich zu den derzeitigen Alternativen. Tissue Engineering Organe, wie z. B. die Blase3, die Harnröhre4, die Luftröhre5und Venen6,7, erfolgreich in der Klinik eingesetzt werden.

Tissue engineering, um personalisierte Transplantate zu produzieren erfordert eine Transplantat von einem Spender, gefolgt von Decellularization und Recellularization. Decellularization ist eine vielversprechende Technologie, Zellen von Geweben und Organen8,9,10zu entfernen. Decellularization kann von bestimmten physikalischen, chemischen und enzymatischen Methoden11 oder durch die Kombination durchgeführt werden. Zur optimalen Nutzung dieser Methoden können decellularized Gewebe ähnliche strukturelle und funktionelle Proteine in einer extrazellulären Matrix, die ähnlich wie bei nativen Gewebe haben. Solche Organe besitzen die Fähigkeit, Anhaftung, Migration, Proliferation und Differenzierung von eingehenden Stammzellen zu verbessern.

Recellularization ist ein dynamischer Prozess der Aussaat Zellen in das Transplantat und Empfänger Stammzellen für klinische Transplantation genutzt werden. Stammzellen, die derzeit für solche Zwecke benutzt sind Knochenmark mesenchymale und Orgel Bewohner3,5,6. Tier- und forschungsorientierte Studien haben Stammzellen aus mesenchymalen Ursprungs verwendet, die fetale und induzierte pluripotente12,13,14. Dieser Prozess erfordert einen Bioreaktor (eine Kammer, die hält der Vene und bietet die notwendigen Voraussetzungen wie Druck, Temperatur, Gase und pH-Wert), Zellen und Nährmedien. Die Herausforderung bei der Recellularization ist, erhalten die erforderliche Anzahl von Zellen eines bestimmten Typs und einer seeding Strategie durch die Zellen ganze Gewebe oder Organ erreichen können. Obwohl keine vollständige Gewebe oder Organ strukturell und funktionell wurde generiert und ausgewertet, bis jetzt, einige Verbesserungen auf dem Gebiet und die ersten Ergebnisse zeigen die künftige Möglichkeit15. Die Schlüsselfunktion der Vene liegt in der luminalen Endothel, das Infiltration von Entzündungszellen in Gewebe und die mittleren Glattmuskel-Ebene, die hilft bei der Verengung und bietet auch die Kraft, um Blutdruck16halten steuert. Studien haben gezeigt, dass bei Schäden, Endothelialization Anastomose oder aus zirkulierenden endothelialen Vorläuferzellen (EPC) im Blut17,18,19auftritt. Unsere Strategie für die Recellularization der Venen stützt sich auf die im Blut zirkulierenden EPC.

Tissue Engineering von Venen und Arterien wurde von mehreren Gruppen, die nach verschiedenen Decellularization und Recellularization Strategien20,21durchgeführt. Unsere Fraktion hat auch durchgeführt und entwickelt Strategien für Beckenkamm und Mamma Venen6,7Decellularization und Recellularization. Decellularization wurde von Agitation von der Ader im Triton X-100, Tri-n-Butyl-Phosphat (TnBP) und Enzym Deoxyribonuclease (DNase) durchgeführt. Die Recellularization erfolgte mittels Knochenmark abgeleitet Endothelzellen und glatten Muskel Zellen6 oder peripherem Blut7. Die Adern recellularized entweder Protokoll zeigten klinische Versprechen bei der Bereitstellung von funktionellen Blut-Versorgungsmaterial in der Transplantation von pädiatrischen Patienten mit extra hepatische portalader Obstruktion6,7.

Wir haben derzeit eine modifizierte Version des gleichen Protokolls für die verbesserte und einfache Durchführung der Decellularization, Recellularization und Bioreaktor Umgang mit kleinem Durchmesser Venen entwickelt. Die aktuellen Decellularization Protokoll Perfusion der Reinigungsmittel durch die Vene mit Druck statt Agitation mit Reinigungsmitteln. Das Recellularization-Protokoll beinhaltet einen zusätzlichen Schritt der Vorkonditionierung zur Verbesserung der Zelladhäsion und die Zugabe von Wachstumsfaktoren im zirkulierenden Blut zur Verbesserung der Zelladhäsion, überleben und Verbreitung. Wir haben auch das Design des Bioreaktors mit handelsüblichen Produkten verbessert. In diesem Beitrag präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des modifizierten Protokolls zur Durchführung von Decellularization und Recellularization des menschlichen saphenous Adern.

Protocol

Das Gewebe verwendet, und das Protokoll dieses Papiers folgt die ethischen Richtlinien der Universität Göteborg. (1) Gewebe Zubereitung und Lagerung Schneiden Sie das umgebende Gewebe aus der abgerufenen stammvenen mit chirurgischen Pinzetten und Scheren.Hinweis: Die stammvenen wird von der unteren Extremität des Menschen von Gefäßchirurgen durchschnitten. Die stammvenen verwendet in diesem Papier ist ein unbenutzten Teil nach Bypass-Operation. Um auslaufen zu verhindern während der Perfusion, verbinden Sie die Seitentrieben an ihren Enden mit Nahtmaterial und Zange. Halten Sie die Vene in einem 50 mL-Tube mit 40 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS). Waschen Sie die Vene durch eine Änderung PBS 2 – 3 Mal um überschüssiges Blut zu entfernen. Speichern Sie die Vene durch das Einfrieren bei-80 ° C. 2. Vorbereitung des Decellularization-Setups und Recellularization Bioreaktor Hinweis: Mit Schere, Schnitt die Silizium-Rohre, wie in Tabelle 1dargestellt. Decellularization Setup 1 (für Triton x-100-Perfusion und waschen) Bis 2 L Kammer (Kunststoffwanne), kleben Sie alle drei Stücke von Rohr A wie in Figur 1Adargestellt.Hinweis: Kleben Sie einen Schlauch an einer Wand, wo der Boden der Kammer (Waschmittel Eingang) berührt, und die anderen zwei Röhren an der gegenüberliegenden Wand mit einem Abstand von ca. 5-10 cm dazwischen abhängig von der Länge der Vene. Mindestens 5 cm dieser Röhren sollten auch dem Kammerboden (Vene der Einlass und Auslass) mit Klebeband befestigt. Über die männlichen und weiblichen Luer-Anschlüsse in Reihe anschließen das Waschmittel Einlass Röhre zu Röhre B gefolgt von Rohr F, Rohr C und schließlich an die Vene. Ort der Röhre F in die Kassette von der peristaltischen Pumpe ich. Nehmen Sie ein anderes Rohr C und verbinden Sie ein Ende der Vene Outlet. Legen Sie das andere Ende in das Glas mit der Grundablass Schlauch, das 45 cm über der Kammer (Waschmittel Outlet) befindet, und kleben Sie es sichern. Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende in der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in die Vene Kammer.Hinweis: Die Bilder der vollständigen Setup (rote Pfeile), Kammer und Fließrichtung (weisse Pfeile) sind in Abbildung 1Agezeigt. Decellularization Setup 2 (für TnBP Perfusion) Nehmen Sie eine 1 L-Glas, und platzieren Sie ein Ende des Rohres C (Waschmittel Einlass) in das Glas, bis das Rohr das Glas Boden berührt. Schließen Sie das andere Ende an Rohr F gefolgt von Rohr C. Ort das andere Ende des Schlauches C in das Glas bis halbe Tiefe (Ader Eingang). Setzen Sie die Kassette der peristaltischen Pumpe Rohr F ich. Rohr D und schreiben ein Ende in das Gefäß (Vene Steckdose) bis halbe Tiefe und das andere Ende in das Glasgefäß mit dem unteren Schlauch 45 cm Höhe aus der Vene Einlass (Waschmittel Steckdose). Um zu sichern, kleben Sie das Waschmittel Einlass und Auslass Röhren. 1 L-Glas auf einen Magnetrührer und halten Sie den Magneten in der Flasche. Nehmen Sie Rohr G und schieben Sie ein Ende auf der schlauchauslauf das Glasgefäß und stecken Sie das andere Ende in 1 L Glas.Hinweis: Das Bild des kompletten Setups (rote Pfeile), Kammer und Strömung Richtung (weisse Pfeile) ist in Abbildung 1 bgezeigt. Decellularization Setup 3 (für DNase Perfusion) Eine 250-mL-Glasflasche und schreiben Sie beide Enden des Schlauches C. Ort der mittlere Bereich des Rohres in die Kassette der peristaltischen Pumpe II.Hinweis: Ein Ende der Röhre ist die Lösung-Bucht und das andere Ende des Schlauches ist an die Vene Einlass. Die Vene Steckdose frei in Lösung bleibt. Legen Sie das ganze Setup inklusive Pumpe bei 37 ° C. Das Bild des vollständigen Setup und Fließrichtung wird in Abbildung 1dargestellt. Recellularization Bioreaktor Halten Sie bereit alle Teile wie in Abbildung 2Agezeigt. Wie in Abbildung 2 bgezeigt, nehmen Sie die 4-Port-Kappe und legen Sie in jedem Hafen, Rohr H (Ader Steckdose) tube ich (Medien-Eingang) und Rohr J (Ader Eingang). Stecken Sie das andere Ende des Schlauches H in der 4th Anschluss (Medienunternehmen).Hinweis: Der Blick auf die 4-Port-Kappe von oben ist in Abbildung 2gezeigt. Schneiden Sie für einfache Einfügung von Rohren die Kanten zu einer scharfen Spitze mit einer Schere. Biegen Sie das andere Ende des Schlauches J in U-Form und binden Sie es mit einer Naht. Schließen Sie die reduzierenden Stecker an den inneren Enden der Röhren H & J. Legen Sie die 60 mL-Tube mit flachem Boden in der 250 mL Glasflasche und platzieren Sie die obige gemachte Setup in das Rohr wie in Abb. 2Ddargestellt. Wie in Abbildung 2Edargestellt, schließen Sie Schläuche K, E und K in Reihe an. Schließen Sie ein K, die Vene Einlass und ein weiteres Rohr K an die Medien.Hinweis: Die schematische Darstellung des Setup und Fließrichtung ist in Abbildung 2Fgesehen. Den Bioreaktor durch Autoklavieren zu sterilisieren. 3. Vorbereitung der Lösungen Lösung 1 (10 X Wasser): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 2 g Natriumazid und 18,6 g der Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Lösung 2 (1 X Wasser): nehmen Sie 100 mL der Lösung 1 und 900 mL Reinstwasser. Lösung 3 (5 x Triton x-100): 950 mL Reinstwasser, hinzufügen, 50 mL von Triton x-100, 1 g Natriumazid und 9,3 g EDTA. Rühren Sie, bis aufgelöst. Lösung 4 (1 x Triton x-100): 200 mL der Lösung 3 einnehmen und 800 mL Reinstwasser. Lösung 5 (1 X TnBP): 990 mL der Lösung 2 10 mL TnBP mit einer 10 mL-Pipette hinzufügen. Lösung 6 (40 Kunitz Einheiten/mL DNase): Fügen Sie 2.000 Kunitz Einheiten der DNaseI in 50 mL Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung enthält CaCl2 und MgCl2. Frisch zubereiten und sofort nutzen. Lösung 7 (PBS): Fügen Sie 24 g Natrium-Chlorid, 0,6 g Kaliumchlorid, 4,32 g Natrium Phosphat und 0,72 g Kalium Phosphat 3 L von Reinstwasser hinzu. Rühren Sie, bis aufgelöst. Den pH-Wert 7,4 einstellen. 1 L des PBS in den Autoklaven sterilisieren und getrennt zu lagern. Lösung 8 (0,1 % Peressigsäure): 50 mL sterile Lösung 7, 50 µL Peressigsäure hinzufügen. Frisch zubereiten und sofort nutzen. 4. Vorbereitung der endothelialen Medium 5 mL L-Glutamin, 5 mL Anti-Anti, 50 mL von Humanserum AB und alle Komponenten des EGM-2 Wachstumsfaktor Kit außer fötalen Rinderserum bis 500 mL des MCDB131 Mediums unter einer sterilen Haube hinzugeben. 5. Decellularization der Stammvenen Die menschlichen stammvenen von-80 ° C bei Zimmertemperatur Auftauen. Wieder bei-80 ° C eingefroren und wieder bei Raumtemperatur Auftauen. Eine Biopsie von 2 mm Länge mit einer Schere ausschneiden und fixieren in Formaldehyd für 24-48 h bei Raumtemperatur. Binden Sie jedes Ende der Vene, die Widerhaken eines männlichen und weiblichen Luer-Anschluss mit einer Naht. Schließen Sie die Vene Decellularization Setup 1 und füllen Sie 1 L Lösung 2. Technologieprodukte für 15 min bei 35 mL/min leeren Sie den Inhalt des Setups. Fügen Sie 1 L Lösung 4 und Technologieprodukte für 4 h 35 mL/min. entleeren Sie den Inhalt des Setups. Fügen Sie 500 mL der Lösung 2 und Technologieprodukte für 5 min. entleeren Sie den Inhalt des Setups. Wiederholen Sie diesen Schritt. Perfusion Setup 1 trennen Sie die Vene und verbinden Sie mit Perfusion Setup 2. Fügen Sie 1 L Lösung 5, schalten die Rührer und Technologieprodukte für 4 h bei 35 mL/min.Hinweis: Lösung 5 sucht nach dem Einschalten auf die Rührer und Perfusion bewölkt. Trennen Sie die Vene von Perfusion Setup 2 und waschen Sie der Vene von innen und außen mit Spritze oder einer Pipette 10 mL in 4 Änderungen von Reinstwasser für 5-10 min. Verbinden Sie die Vene mit Perfusion Setup 3, 50 mL der Lösung 6 hinzufügen und durchspülen mit 10 mL/min in einer Kammer 37 ° C für 4 Std. leeren Sie den Inhalt des Setups und das Setup die Vene trennen. Verbinden Sie die Vene Perfusion Setup 1, füllen Sie 1 L Lösung 2 und über Nacht 35 mL/min. Wiederholen Sie Schritt 5.4 Schritt 5.9 4 mal (für eine Gesamtmenge von 5 Zyklen) durchspülen. Nehmen Sie eine Biopsie wieder wie in Schritt 5.2.Hinweis: Überspringen Schritt 5,8 zweiten Teil in Zyklen 1 und 3. Leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 2 und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung 2 nach 12 Uhr leeren Sie den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1L das Reinstwasser und Technologieprodukte für 24 h bei 35 mL/min Änderung der Reinstwasser nach 12 h.Empty den Inhalt des Setups. Füllen Sie 1 L Lösung 7 und durchspülen Sie 7 nach 12 h 24 h bei 35 mL/min Änderung Lösung. 6. Überprüfung der Decellularization Waschen Sie das Formalin fixiert Biopsien in Reinstwasser für 15 min. Prozess in einem Gewebe-Prozessor nach Standardprotokollen und Einbettung in Paraffin22. 5 µm-Abschnitte, die mit einem Mikrotom geschnitten und Fleck mit Meyers Hämatoxylin und 0,2 % alkoholischer Eosin (H & E) nach Standardprotokollen22. Sehen Sie unter dem Mikroskop für den Verlust der Kerne in decellularized Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe zu überprüfen. (7) recellularization Sterilisieren Sie die Vene, indem man sie in ein 50 mL-Tube mit 50 mL der Lösung 8. Schütteln Sie im Shaker für 1 h bei 37 ° c bei 80 Umdrehungen pro Minute (u/min) Behandeln Sie die Vene unter Laminar-Flow (LAF) Kabinett von nun an Sterilität zu pflegen. Übertragen Sie die Vene mit sterilen Pinzette, eine neue 50 mL-Tube mit 50 mL sterile Lösung 7 und 500 µL Anti-Anti. Wie oben für 12 h. Änderung Lösung 7 mindestens zweimal zwischendurch schütteln. Mit sterilen Pinzette, übertragen Sie die Vene, eine neue Tube 50 mL und 50 mL endotheliale Medien. Regen Sie wie oben für 11 h. Montieren Sie den Bioreaktor mit sterilen Handschuhen unter die LAF Schrank. Binden Sie die Vene in des Bioreaktors Vene Einlass und Auslass mit sterilen Naht und Zange. Schließen Sie die Vene an den Bioreaktor und füllen Sie mit dem gleichen Medium. Hinzufügen von Heparin bei 50 IU/mL und Technologieprodukte für 1 h bei 2 mL/min bei 37 ° C. 15-25 mL frisches Blut (je nach Länge der Vene) vom Spender in Heparin beschichtet Vacutainer Röhrchen sammeln und 1:1 mit Steen Lösung verdünnen. Später fügen Sie hinzu, endokrine Drüse abgeleitet vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-EG, 80 ng/mL), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-b, 4 µL/mL) und Acetyl-Salicylsäure (5 µg/mL). Verschieben des Bioreaktors in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 und Technologieprodukte für 48 h mit 2 mL/min. Ca. nach 12 h, bewegen des Bioreaktors, ein Kabinett, LAF nehmen Sie einen Tropfen Blut und Messen Sie Glukose mit Hilfe einer Blutzuckermessung Gerät. Wenn der Pegel unter 3 Mmol/L ist, fügen Sie Glukose zu bringen im Bereich von 7-9 Mmol/L. Wiederholen Sie diesen Schritt alle 8-12 h. Verschieben Sie nach 48 h des Bioreaktors in die LAF Kabinett und abtropfen lassen Sie das Blut aus dem Bioreaktor. 30 mL sterile Lösung 7 hinzufügen und für 5 min. Abfluß die Lösung durchspülen. Geben Sie 30 mL sterile Lösung 7 und Technologieprodukte für 5 min. wiederholen zweimal, oder bis die blutrote Farbe verloren geht.Hinweis: Die Biopsie kann zur Überprüfung der Zelle Anlage eingenommen werden. Trennen Sie die Vene, 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere schneiden und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie zu, wie im Schritt 5.2 angegeben und schließen Sie die Vene wieder an den Bioreaktor (optionaler Schritt an). 30-45 mL von endothelialen Medium und Technologieprodukte für 96 h im Inkubator mit 2 mL/min.Hinweis: Fügen Sie endotheliale Medium bis die Vene untergetaucht ist. Verschieben Sie des Bioreaktors in den LAF-Schrank, trennen Sie die recellularized Vene, schneiden Sie 5 mm Kanten der Ader mit einer Schere und entsorgen. Nehmen Sie eine Biopsie, wie im Schritt 5.2 angegeben. 8. Überprüfung der Recellularization Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 6 und führen Sie H & E Färbung. Die Folien unter dem Mikroskop auf das Vorhandensein von Zellen zu untersuchen.

Representative Results

Die grobe Morphologie eine normale Vene ist Licht rot (Abb. 3A). Die rote Farbe ist in progressive Decellularization Zyklen verloren (2, Abb. 3 b-Zyklus; Zyklus 3, Abbildung 3) und durch die 5th Zyklus, es sieht blass und weiß (Abbildung 3D). Die recellularized Vene nach Durchblutung (Abbildung 3E) und endotheliale Medien Perfusion (Abbildung 3F) sieht leuchtend rot in der Farbe. Die 5 Zyklen der Decellularization Behandlung entfernt erfolgreich die Zellen aus der Vene wie keine blaue Kerne in der H & E Färbung (Abbildung 4 b) zu sehen waren. Im Gegensatz dazu wurden mehrere Kerne in die normale Richtung (Abb. 4A) gesehen. Das Vorhandensein von angeschlossenen Zellen auf der luminalen Seite sieht in der H & E Färbung in der recellularized Ader mit Blut für 48 h (Abbildung 4, Schwarze Pfeile) und nach Perfusion mit dem Endothel Medium für 96 h (Abbildung 3D, Schwarze Pfeile). Abbildung 1 : Montage der Perfusion Setups für Decellularization. A) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 1 für Triton x-100 und waschen. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. B) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 2 für TnBP Perfusion. Ebenso wie in Decellularization Setup 1, weiße Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen ein- und Ausläufe für Venen- und Lösungen. C) das Bild zeigt das montierte Decellularization Setup 3 für Deoxyribonuclease Perfusion. Die weißen Pfeile zeigen den Fließweg für Lösungen und rote Pfeile zeigen die Einlässe für Venen- und Lösungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  Abbildung 2 : Vorbereitung und Montage des Bioreaktors für Recellularization. A) Bild zeigt zur Montage des Bioreaktors erforderliche Materialien. B) Bild von der Innenseite des 4-Port-Kappe zeigt die Platzierung der Anschlüsse (rote Pfeile), Reduzierung Punkte verbinden Vene Einlass und Auslass (weisse Pfeile) und Anordnung der Rohre H, I und J. Das freie Ende des Schlauches H befindet sich in den Bioreaktor Medien zurück. C) die jeweiligen Röhren und ausgehen können von der Oberseite 4 Port GAP gesehen werden. D) Bild zeigt den montierten Bioreaktor. E) Bild zeigt das ganze Bioreaktor-Setup mit der peristaltischen Pumpe. Die Rohre K verlängern Verbindungen aus dem Bioreaktor zur peristaltischen Pumpe. F) die schematische Darstellung des gesamten bioreaktorsystem Perfusion. Die orangefarbenen Pfeile zeigen die Richtung des Flusses. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  Abbildung 3 : Brutto-Morphologie der Venen bei Decellularization und Recellularization. A) die grobe Morphologie des normalen Vene sieht leuchtend rot in der Farbe. Die Farbe ist mit einer zunehmenden Zahl von Decellularization Zyklen verloren B) 2-Zyklus und C) 3-Zyklus. D) von 5 Zyklen, die Vene sieht blass und weiß. Die Vene nach Vorrichtung mit E) Blut für 48 h und F) mit dem Endothel Medium für 96 h sieht wieder leuchtend rot in der Farbe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Charakterisierung von decellularized und recellularized Venen. Die Hämatoxylin und Eosin Färbung Bild des (A) normale Vene enthält viele blaue Kerne aber fehlen sie in (B) decellularized Vene. In die Vene mit recellularized C) Blut für 48 h und mit D) endotheliale Medium für 96 h, Befestigung der Zellen (Schwarze Pfeile) im Lumen bemerkt wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Discussion

Die hier vorgestellte für Decellularization der saphenous Adern Technik ist eine einfache und kostengünstige Methode, die auch auf alle kleinen Durchmesser Venen wie Nabelschnur und Mamma Adern angewendet werden kann. Die Decellularization Lösungen und deren Konzentrationen in dieser Methode verwendet werden von unserer bisherigen Ergebnisse6,7. Obwohl wir 5 Zyklen von Decellularization empfehlen, haben wir in bestimmten Adern auch komplette Decellularization in 3 Zyklen festgestellt. Jedoch wurden reproduzierbare Ergebnisse mit 5 Zyklen. Die Anwendung dieses Protokolls, wir decellularized Venen mit unterschiedlichen Längen bis zu 30 cm erfolgreich (unveröffentlicht Ergebnis). Aufhebung der Decellularization Lösung Steckdose 45 cm wird einen Druck von 33 MmHg in der Vene erstellen. Nach unserer Erfahrung haben wir dies als wichtigen Schritt in einem die ganze Vene einheitlich und reproduzierbar in 5 Zyklen festgestellt. Der gewählte Druck ist 3 mal höher als der normale stammvenen Druck (5-10 MmHg) aber ist das gleiche wie inkompetent Venen (Krampfadern)23. Darüber hinaus vermuten wir, dass diesen hohe Druck eine bedeutende Kraft auf die venenwände entsteht und daher, effizienter und schneller Zelle entfernen helfen kann.

Da TnBP ein organisches Lösungsmittel ist und unlöslich in Wasser, rühren das Waschmittel bis wird es bewölkt wichtig ist; Andernfalls wird das Waschmittel schwimmen. Aus dem gleichen Grund wurde um TnBP gemischt in Lösung zu halten das Waschmittel auslassrohr am oberen Rand das Glasgefäß mit der schlauchauslauf gelegt. Effiziente Entfernung von TnBP aus der Vene nach seiner Verwendung in jedem Zyklus durch das Fehlen von schwimmenden TnBP Tröpfchen im Wasser gewaschenen gesehen werden kann. Wir haben auch festgestellt, dass die DNase-Schritt überspringen auch eine decellularized Gewebe produziert, aber in einigen Fällen wurde ein vergleichsweise hoher DNA-Gehalt im decellularized Gewebe bemerkt. Hoher Druck und hohe Durchflussraten nicht für effiziente DNase Tätigkeit erforderlich sind, kann ein geringer Perfusion (10 mL/min) verwendet werden. Eine unterschiedliche Peristaltische Pumpe diente als seiner geringeren Größe in einfache Handhabung des Setups hilft. Da wir diesen Schaden die meisten Zellen während Decellularization resultiert in Zyklus 2 bemerkt haben, empfiehlt es sich, überspringen DNase-Behandlung während der Zyklen 1 und 3 (unveröffentlichte Ergebnis). Obwohl die Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinen der extrazellulären Matrix in dieser Handschrift nicht durchgeführt wurden, zeigten unsere bisherigen Erfahrungen mit ähnlichen Decellularization Protokolle die Erhaltung der biomechanischen Eigenschaften, extrazelluläre Matrix Struktur und Proteine7. Obwohl unsere vorläufige Quantifizierung Experimente mit diesen Adern ein ähnliches Ergebnis (unveröffentlicht) produziert, werden unsere bereits veröffentlichten Ergebnisse dieses Vertrauen stärken.

Recellularization mit Blut ist eine bequeme und einfache Prozess vorbei erweitert Knochenmarkzellen, wie man, lange Zelle Expansion Zeiten, spontane Mutationen im erweiterten Zellen, chirurgischen Eingriff und Beschwerden für den Patienten vermeiden kann. Denn es ist bekannt, dass Endothelialization kann auch von zirkulierenden EPC auftreten, wir stellten die Hypothese, dass Perfusion mit Blut gefolgt von Perfusion mit endothelialen Medium wird für Recellularization ausreichend sein. Die Sicherheit der Vene Gewebe konstruiert mit einer ähnlichen Methode ist vom Erfolg der Transplantation gesehen, wenn Kinder mit extra hepatische portalader Obstruktion7zwei solche Venen implantiert wurden. Wir spekulieren, dass die Wachstumsfaktoren in decellularized extrazelluläre Matrix die Befestigung der zirkulierenden EPC vom Blut24zulässt. Recellularization der Venen nach ein ähnliches Protokoll zeigte Zellen positiv für VEGF-Rezeptor-2 und Cluster der Differenzierung (CD) 14 auf das Lumen während CD45 mit dem Ausdruck ihrer Zellen in Adventitia7gesehen wurden. Wir denken auch, dass eine durchgängige endotheliale Schicht nicht in allen Fällen beobachtet werden kann, insbesondere bei Verwendung von Blut aus älteren und kranken Patienten, es ist bekannt, dass solche Personen Zahlen der zirkulierenden Vorläuferzellen Zellen25gesunken. Jedoch wir postulieren, dass Perfusion mit des Empfängers Blut kann viele der Antigene, die wegen Decellularization ausgesetzt sind und kann somit sinkt die entzündliche Nebenwirkungen wenn verpflanzt im Gegensatz zu verpflanzen nur Maske decellularized Blutgefäße. Darüber hinaus kann Durchblutung einzahlen erhöhte Konzentration von Wachstumsfaktoren auf die Lumen und Adventitia, die wiederum vermehrt der zirkulierenden Vorläuferzellen, was zu einem schnellen Prozess des Recellularization in Vivorekrutieren kann.

Die Vorteile des in dieser Studie verwendeten Bioreaktor-Designs sind komplette Autoklavieren, einfache Montage, Wirtschaftlichkeit, einfache Handhabung und die geringste Möglichkeit eines Schadens. Mit Hilfe unserer Erfahrung das aktuelle Design, Venen bis zu 10 cm in der Länge waren recellularized. Obwohl Venen bis zu 25 cm in der Länge kann auch durch die Vene in “U”-Form innerhalb des Bioreaktors zu halten recellularized, dies sollte überprüft werden. Der Bioreaktor Entwurf zeigt, dass die Richtung der Strömung in die Vene gegen die Schwerkraft ist und als solche entwickelt ist, weil es der normalen Strömungsrichtung der für diese Adern in den Menschen ist. 12 h Perfusion der endothelialen mittlerer Stufe ist die Voraussetzung der Vene und erhöhen die Affinität zur Befestigung der eingehenden EPC. Zugabe von zusätzlichen Heparin und Durchblutung für 1 h senkt das Risiko der Bildung von Blutgerinnseln in den Röhren während der Durchblutung.

Das Volumen des Blutes erforderlich ist abhängig von der Länge der Vene. Das Grundprinzip, die, das wir für das Blutvolumen zu folgen, ist, dass die Vene in Blut getaucht werden sollten. Beim Umgang mit Blut Volumen größer als 45 mL, möglicherweise gelegentlich mischen erforderlich um Zelle Ansammlung in der Unterseite des Bioreaktors zu verhindern. Wir haben Steen Lösung für Blut, denn er einen hohen Anteil an Proteinen und Komponenten erforderlich enthält, um Gewebe während Organ Transplantation26,27gesund zu halten. Zugabe von VEGF und b-FGF ist vorteilhaft, da sie potente angiogene Wachstumsfaktoren28 sind und ihre Anwesenheit Migration, Proliferation und Differenzierung von EPC29,30,31,32 induziert . Die Höhe der VEGF hinzugefügt basiert auf unserer früheren unveröffentlichte Ergebnisse, wo die Verbreitung von EPC 80 ng/ml gesehen wurde. Zugabe von Aspirin hemmt die Aktivierung von Thrombozyten33 dadurch verringert die Chancen für ihre Verbundenheit mit endotheliale Schicht. Kontinuierliche Überwachung und Zugabe von Glukose werden auch vorteilhaft für die Zellproliferation und Hämolyse der roten Blutkörperchen zu verhindern.

Da nur eine einfache Blutprobe vom Empfänger erforderlich ist, kann es als eine einfache und praktikable Verfahren erfordern weniger Fachwissen betrachtet werden. Obwohl der gesamte Vorgang von Anfang bis Ende hier gezeigten 20 Tage dauert, speichern die decellularized Venen als eine aus dem Regal Produkt wird das Verfahren bis 8 Tage für Patienten zu verkürzen. Obwohl Lagerung von decellularized Venen Recellularization Effizienz technisch nicht beeinflussen sollte, muss es ausgewertet werden. Tissue-Engineering Venen erzeugt dieses Verfahren können in der Klinik für Bypass-Operationen, verstopfte Adern, venöse Insuffizienz führt zu Krampfadern ohne Immunsuppression und so für eine bessere Qualität der ersetzen verwendet werden Leben für den Patienten.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten danken Professor Anders Jeppsson für Hilfe bei der Bereitstellung von Blutgefäßen in den Experimenten verwendet. Diese Studie wurde finanziert durch die LUA ALF Zuschuss an SSH.

Materials

4-Port Cap CPLabSafety WF-GL45-4Kit
Acetyl salicylic acid Sigma Aldrich A5376
Anti-Anti Life Technologies 15240-062
B-FGF Lonza cc-4113B
Blood Glucose monitoring system – Free style Lite Abbott 70808-70
D-Glucose Sigma Aldrich G8769
DNase-I Worthington LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 Sigma Aldrich D8662
EDTA disodium salt dihydrate AlfaAesar A15161.OB
EGM-2 Growth Factors Kit Lonza CC-4176
EG-VEGF Peprotech 100-44
Glass bottle 250ml VWR 2151593 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass bottle 1L VWR 2151595 Any bottle with GL45 cap can be used
Glass jar 500ml with bottom hose outlet Kimble Chase Life Science 14607
Heparin Leo 387107
Heparin Coated Vacutainer Tubes Becton Dickinson 368480
Human AB Serum Sigma Aldrich H3667
L-Glutamine Life Technologies 25030-024
Luer Female with 1/8" ID Barb Oina LF-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Female with 3/32" ID Barb Oina LF-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 3/32" ID Barb Oina LM-1.5PP-QC For 2X4mm silicon tube
Luer Male with 1/8" ID Barb Oina LM-2PP-QC For 3X5mm silicon tube
Luer Male with 5/32" ID Barb Cole Parmer EW-45518-06 For 5X8mm silicon tube
MCDB 131 Life Technologies 10372-019
Per acetic acid Sigma Aldrich 433241
Peristaltic pump I Masterflex 7524-45 For Decellularization setup 1 and 2. The cassette used is 7519-75
Peristaltic pump II Ismatec ISM941 For Decellularization setup 3 and Recellularization bioreactor.
Potassium chloride Sigma Aldrich P5405
Potassium hydrogen phosphate Sigma Aldrich P9791
Reducing Connector 1.5mmX2.5mm Biotech ISM569A
Shaker Ika KS4000 i  control
Sodium Azide Sigma Aldrich 71290
Sodium chloride Sigma Aldrich 13423
Sodium hydrogen phosphate Merck 71640-M
Steen solution Xvivo 19004
Suture Agnthos 14817
Tri-n-butyl Phosphate AlfaAesar A16084.AU
Triton-X-100 AlfaAesar A16046.OF
Tube 60ml with flat base Sarstedt 60596
Tube A VWR 2280706 Cut 3 pieces, each of 25 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube B VWR 2280706 Cut 1 piece of 35 cm length for decellularization perfusion steup
Tube C VWR 2280706 Cut 5 pieces, each of 75 cm length for decellularization perfusion steups 1-3
Tube D VWR 2280706 Cut 1 piece of 90 cm length for decellularization perfusion steup 2
Tube E VWR 2280706 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube F VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube G VWR 2280713 Cut 2 pieces, each of 15 cm length for decellularization perfusion steup 1 and 2
Tube H VWR 2280703 Cut 1 piece of 15 cm length for recellularization perfusion steup
Tube I VWR 2280703 Cut 1 piece of 20 cm length for recellularization perfusion steup
Tube J VWR 2280703 Cut 1 piece of 25 cm length for recellularization perfusion steup
Tube K VWR 2280703 Cut 2 pieces, each of 35 cm length for recellularization perfusion steup
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Referencias

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Kumar Kuna, V., Xu, B., Sumitran-Holgersson, S. Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins. J. Vis. Exp. (137), e57803, doi:10.3791/57803 (2018).
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