Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok
Summary
Ovariële weefselcultures kan worden gebruikt als modellen van follikel ontwikkeling, ovulatie en follikel atresie en regulerende mechanismen van dynamische ovariële processen aan te geven.
Abstract
Zoogdieren vrouwtjes eisprong periodiek een bijna constante aantal eicellen tijdens elke cyclus van estrus. Om dergelijke regelmaat en periodiciteit, verordening treedt op op het niveau van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as en op de ontwikkeling van de follikels in de eierstokken. Ondanks actieve studies zijn follikel ontwikkelingsmechanismen niet duidelijk, vanwege de verschillende stappen van de activering van de slapende primordiale follikel tot ovulatie, en de complexiteit van de verordening dat verschilt in elk folliculaire fase. Voor het onderzoek naar de mechanismen van ontwikkeling van de follikel en de dynamiek van de follikels gedurende de gehele estrus cyclus, we een muis ovariële weefselkweek model ontwikkeld dat kan worden gebruikt voor het observeren van de follikel ontwikkelen met behulp van een microscoop. Systematische follikel ontwikkeling, periodieke ovulatie en follikel atresie kunnen alles worden gereproduceerd in de gekweekte ovarium-model en de kweekomstandigheden experimenteel kunnen worden gedifferentieerd. We laten hier zien het nut van deze methode in de studie van de regelgevende mechanismen van ontwikkeling van de follikel en andere ovariële verschijnselen.
Introduction
Vrouwelijke muis eierstokken verscheidene duizend follikels1bevatten, en periodieke ovulatie rijpt ongeveer tien eicellen op elke cyclus van estrus. Follikels zijn ingedeeld in verschillende ontwikkelingsstadia: primordial, primaire, secundaire, follikelgroei, en Graafian de follikels, afhankelijk van de vorm van de granulosa cellulaire laag rond elke oöcyt. Meeste primordiale follikels zijn slapende, en sommige van hen zijn geactiveerd en uitgroeien tot primaire follikels bij elke estrus cyclus2. Na de secundaire folliculaire fase, wordt ontwikkeling van de follikel voornamelijk geregeld door gonadotrofinen, folliculaire stimulerende hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). Echter, primordial en primaire follikel ontwikkeling is onafhankelijk van choriongonadotrofine, en de regulerende mechanismen die deze fasen regelen blijven slecht inderstood3,4,5. Naast de groeifactoren en hormonen, wordt de primordiale en primaire follikel geregeld door de interacties tussen follikels6,7. Dus we analyses van de follikel dynamics uitgevoerd in muis eierstok weefsels en onderzocht de bijbehorende regulerende mechanismen met behulp van ovariële weefselcultures8,9,10.
Hierin, introduceren we twee methoden in webobjectmodel ovariële weefselkweek. De eerste wordt gebruikt voor het analyseren van de follikel ontwikkeling door meting van de folliculaire gebieden, en de tweede wordt gebruikt voor het bestuderen van het reguleringsmechanisme tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fase met transgene muizen. Voor de analyse van de ontwikkeling van de follikel, we voornamelijk gebruikt eierstokken van 4 – weken oude vrouwelijke muizen omdat zij toestaan voor eenvoudige visualisatie van follikels. Om periodieke ovulatie en model in vivo de ontwikkeling van de follikel, wij gereproduceerd LH-piek en waargenomen ovulatie, follikel atresie en secretie van oestradiol weefselkweek omstandigheden. Beelden van de gekweekte eierstokken werden gevangen genomen en de ontwikkelingsprocessen follikel werden geanalyseerd door tracering veranderingen in de folliculaire gebied. In heldere veld microscopie analyses was het onderscheid tussen primordiale en vroege primaire follikels echter onduidelijk. Zo ontwikkelden we een methode voor het detecteren van kleine follikels en onderscheid maken tussen de primordiale, primair, en secundair follikel in gekweekte ovariële weefsels met behulp van Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 en de R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken op dag 0 en 4 na geboorte11. Oog1 uitdrukking is aantoonbaar in eicellen na inwerkingtreding meiose, en geleidelijk aan toeneemt met de ontwikkeling van de follikel, waardoor observatie van de overgang van primordial naar primaire follikels met behulp time-lapse beelden van gekweekte eierstok weefsel11 ,12. Hoewel de morfologische methodes zijn gebruikt om de studie van de factoren die activeren van sluimerende primordiale follikels13,14,15,16, is ontwikkeling van de fysiologische follikel in de eierstokken moeilijk te observeren, en de gevolgen van verschillende factoren blijven genfunctieonderzoek. De huidige cultuur-methoden werden ontworpen om aan te pakken van deze schaarste in real-time analyses van doel factoren.
In de huidige studie, we bijgehouden folliculaire ontwikkelen met behulp van een time-lapse beeldvorming methode en het proces van ontwikkeling van de follikel gekenmerkt. Onze nieuwe methoden bieden een ongekende hulpmiddel voor het onderzoeken van de Fysiologie van de eierstokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie ontwikkelden we twee nieuwe methoden voor het bestuderen van de ontwikkeling van de follikel in de eierstokken van de muis. De eerste methode houdt cultuur van gesneden ovariële volwassen muizen weefsels gevolgd door analyse van de ontwikkeling van de follikel en de tweede impliceert het gebruik van time-lapse imaging om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van de follikel tijdens de gonadotrofinen-onafhankelijke-fase. Eerder, wij de huidige eierstok weefselkweek methode gebruikt ter beoordeling van…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Naojiro Minami (Universiteit van Kioto) voor het verstrekken van de Oog1pro3.9 muizen. Dit onderzoek werd gesteund door de JSPS (KAKENHI # JP15H06275) en de Stichting van de Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
Referencias
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
