Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og metoden til paraffin skæring og counterstaining. Dette er en nem og hurtig procedure til overvågning af genekspression under udvikling, som også kan anvendes til væv dele, organer eller dyrkede celler.
Escherichia coli LacZ gen, kodning β-galactosidase, er i vid udstrækning brugt som reporter for genekspression og som røbestof i celle lineage undersøgelser. Den klassiske histokemiske reaktion er baseret på hydrolyse af substrat X-gal i kombination med jern og jern ioner, som producerer en uopløselig blå bundfald, der er let at visualisere. Derfor, β-galactosidase aktivitet fungerer som en markør for gen af interesse udtryk mønster efterhånden som udviklingen skrider frem. Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og den efterfølgende metode til paraffin skæring og counterstaining. Derudover fastsættes en procedure for afklaring hele embryoner til bedre visualisere X-gal farvning i dybere områder af embryoet. Ensartede resultater er opnået ved at udføre denne procedure, selv om optimering af reaktionsbetingelser er nødvendig for at minimere baggrund aktivitet. Begrænsninger i analysen bør overvejes også, især med hensyn til størrelsen af embryo i hele mount farvning. Vores protokol giver en følsom og en pålidelig metode til registrering af β-galactosidase under musen udvikling, der kan anvendes yderligere frysemikrotomsnit samt hele organer. Således dynamisk gen expression mønstre i hele udvikling kan let analyseres ved hjælp af denne protokol i hele embryoner, men også detaljeret udtryk på cellulært niveau kan vurderes efter paraffin skæring.
For at beskrive bestemte gen expression mønstre, har brug af reporter gener som markører været altafgørende fra Drosophila til pattedyr. Forsøg med transgene og knockout dyr, er den bakterielle β-galactosidase gen (LacZ) af Escherichia coli (E. coli) en af de mest udbredte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyserer hydrolyse af β-galactosides (såsom lactose) i sin monosakkarider (glucose og galactose)5. Dens mest almindeligt anvendte substrat er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycosid, der er hydrolyseret af β-galactosidase giver anledning til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galactose. Først oxideres i en dimer, når de anvendes kombineret med kalium ferri- og ferro-cyanid, producerer en karakteristisk uopløseligt, blå farve bundfald (figur 1)6.
LacZ gen begyndt at blive brugt som en reporter gen over tredive år siden7,8. Normalt, LacZ er indsat neden for en endogen promotor stedet åbne læsning rammen, så det kan bruges i bakteriel og celle kultur at visualisere celler, der indeholder en bestemt indsætte samt i transgene dyr som røbestof af endogene gen expression mønstre under udvikling9. I denne henseende har visualisering af β-galactosidase aktivitet været flittigt brugt i Drosophila for at forstå de udviklingsmæssige og cellulære processer fra enkelt celler til hele væv. Drosophila genetik favorisere generation af stabil linjer som en modificeret P-element konstruktion indeholdende reporter gen LacZ er indsat på tilfældige steder i genomet. Således, når de placeres under indflydelse af enhancer elementer kan det køre sit udtryk på en bestemt måde, væv, der har tilladt en systematisk analyse af udtryk mønstre af mange gener i løbet af de sidste to årtier10. Desuden giver brug af Transgene mus til at overvåge LacZ genekspression også påvisning af gen rekombination begivenheder af Cre-loxP medieret rekombination og lokalisering af mutant embryonale stamceller derivater i kimære analyser 11, som muliggør kontrol af LacZ udtryk i specifikke væv såvel som tidsmæssigt. Også, i hele embryoner, påvisning af β-galactosidase aktivitet kan producere differential farvning mønstre på forskellige intensiteter, der bekvemt kan iagttages på tværs af forskellige udviklingsstadier analysere tidsmæssige ændringer i genekspression 8,12.
I denne artikel præsenterer vi en protokol for at visualisere genekspression gennem X-gal farvning i hele mount væv på tidlige udviklingsstadier af musen embryoner. Vi præsenterer denne histokemiske metode som en yderst følsom og billig teknik, der favoriserer nøjagtig registrering af mærket celler i hele mount prøver eller på cellulært niveau efter paraffin indlejret væv eller embryoner. Metoden giver mulighed for direkte visualisering af farvning i mus væv med minimum baggrunden sammenlignet med andre metoder13.
E. coli LacZ gen har været meget anvendt som reporter i undersøgelser af gen expression mønstre på grund af sin høje følsomhed og lethed af påvisning. Denne protokol beskriver en klassisk metode til påvisning af β-gal udtryk baseret på en enzymatisk reaktion, der er let og hurtig at udføre og billig. Denne metode kan også anvendes uden større ændringer i hele mount embryoner, intakt organer, væv frysemikrotomsnit eller dyrkede celler.
Korrekt anvendelse af denne metode …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke den histopatologiske Service for deres tekniske bistand på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for venligt giver Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo, for at støtte vores projekt og for hendes kritiske læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Peter Bonney til korrekturlæsning af denne artikel. Dette arbejde blev støttet af Universidad Europea de Madrid ved hjælp af tilskud (# 2017UEM01) til C.S.C.
REAGENTS | |||
2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
EQUIPMENT | |||
Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
pHmeter | Crison | Basic 20 | |
Optic fiber | Optech | PL2000 |