Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner
Summary
Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og metoden til paraffin skæring og counterstaining. Dette er en nem og hurtig procedure til overvågning af genekspression under udvikling, som også kan anvendes til væv dele, organer eller dyrkede celler.
Abstract
Escherichia coli LacZ gen, kodning β-galactosidase, er i vid udstrækning brugt som reporter for genekspression og som røbestof i celle lineage undersøgelser. Den klassiske histokemiske reaktion er baseret på hydrolyse af substrat X-gal i kombination med jern og jern ioner, som producerer en uopløselig blå bundfald, der er let at visualisere. Derfor, β-galactosidase aktivitet fungerer som en markør for gen af interesse udtryk mønster efterhånden som udviklingen skrider frem. Her beskriver vi standardprotokol til påvisning af β-galactosidase aktivitet i tidlige hele musen embryoner og den efterfølgende metode til paraffin skæring og counterstaining. Derudover fastsættes en procedure for afklaring hele embryoner til bedre visualisere X-gal farvning i dybere områder af embryoet. Ensartede resultater er opnået ved at udføre denne procedure, selv om optimering af reaktionsbetingelser er nødvendig for at minimere baggrund aktivitet. Begrænsninger i analysen bør overvejes også, især med hensyn til størrelsen af embryo i hele mount farvning. Vores protokol giver en følsom og en pålidelig metode til registrering af β-galactosidase under musen udvikling, der kan anvendes yderligere frysemikrotomsnit samt hele organer. Således dynamisk gen expression mønstre i hele udvikling kan let analyseres ved hjælp af denne protokol i hele embryoner, men også detaljeret udtryk på cellulært niveau kan vurderes efter paraffin skæring.
Introduction
For at beskrive bestemte gen expression mønstre, har brug af reporter gener som markører været altafgørende fra Drosophila til pattedyr. Forsøg med transgene og knockout dyr, er den bakterielle β-galactosidase gen (LacZ) af Escherichia coli (E. coli) en af de mest udbredte1,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyserer hydrolyse af β-galactosides (såsom lactose) i sin monosakkarider (glucose og galactose)5. Dens mest almindeligt anvendte substrat er X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glycosid, der er hydrolyseret af β-galactosidase giver anledning til 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole og galactose. Først oxideres i en dimer, når de anvendes kombineret med kalium ferri- og ferro-cyanid, producerer en karakteristisk uopløseligt, blå farve bundfald (figur 1)6.
LacZ gen begyndt at blive brugt som en reporter gen over tredive år siden7,8. Normalt, LacZ er indsat neden for en endogen promotor stedet åbne læsning rammen, så det kan bruges i bakteriel og celle kultur at visualisere celler, der indeholder en bestemt indsætte samt i transgene dyr som røbestof af endogene gen expression mønstre under udvikling9. I denne henseende har visualisering af β-galactosidase aktivitet været flittigt brugt i Drosophila for at forstå de udviklingsmæssige og cellulære processer fra enkelt celler til hele væv. Drosophila genetik favorisere generation af stabil linjer som en modificeret P-element konstruktion indeholdende reporter gen LacZ er indsat på tilfældige steder i genomet. Således, når de placeres under indflydelse af enhancer elementer kan det køre sit udtryk på en bestemt måde, væv, der har tilladt en systematisk analyse af udtryk mønstre af mange gener i løbet af de sidste to årtier10. Desuden giver brug af Transgene mus til at overvåge LacZ genekspression også påvisning af gen rekombination begivenheder af Cre-loxP medieret rekombination og lokalisering af mutant embryonale stamceller derivater i kimære analyser 11, som muliggør kontrol af LacZ udtryk i specifikke væv såvel som tidsmæssigt. Også, i hele embryoner, påvisning af β-galactosidase aktivitet kan producere differential farvning mønstre på forskellige intensiteter, der bekvemt kan iagttages på tværs af forskellige udviklingsstadier analysere tidsmæssige ændringer i genekspression 8,12.
I denne artikel præsenterer vi en protokol for at visualisere genekspression gennem X-gal farvning i hele mount væv på tidlige udviklingsstadier af musen embryoner. Vi præsenterer denne histokemiske metode som en yderst følsom og billig teknik, der favoriserer nøjagtig registrering af mærket celler i hele mount prøver eller på cellulært niveau efter paraffin indlejret væv eller embryoner. Metoden giver mulighed for direkte visualisering af farvning i mus væv med minimum baggrunden sammenlignet med andre metoder13.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli LacZ gen har været meget anvendt som reporter i undersøgelser af gen expression mønstre på grund af sin høje følsomhed og lethed af påvisning. Denne protokol beskriver en klassisk metode til påvisning af β-gal udtryk baseret på en enzymatisk reaktion, der er let og hurtig at udføre og billig. Denne metode kan også anvendes uden større ændringer i hele mount embryoner, intakt organer, væv frysemikrotomsnit eller dyrkede celler.
Korrekt anvendelse af denne metode …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke den histopatologiske Service for deres tekniske bistand på Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi takker også Dr. Motoharu Seiki for venligt giver Mt4-mmpLacZ mus, og Dr. Alicia G. Arroyo, for at støtte vores projekt og for hendes kritiske læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Peter Bonney til korrekturlæsning af denne artikel. Dette arbejde blev støttet af Universidad Europea de Madrid ved hjælp af tilskud (# 2017UEM01) til C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
Referencias
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
