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Medicina

Valutazione della funzione respiratoria in topi cosciente da doppia camera pletismografia

Published: July 10, 2018
doi:
10.3791/57778
, , , , , , ,
1Institut Universitaire de Cardiologie et de Pneumologie de Québec,Université Laval, 2SCIREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.

Summary

L’obiettivo del presente articolo è quello di fornire una descrizione dettagliata delle procedure consigliate per valutare la funzione respiratoria in topi cosciente da pletismografia a doppia camera.

Abstract

Variazioni di volume di aria creati da un soggetto cosciente respirare spontaneamente all’interno di una scatola di corpo sono alla base della pletismografia, una tecnica utilizzata in modo non invasivo valutare alcune caratteristiche della funzione respiratoria in esseri umani così come in animali da laboratorio. Il presente articolo si concentra sull’applicazione della pletismografia di doppia camera (DCP) nei piccoli animali. Fornisce informazioni di base sulla metodologia, nonché una descrizione dettagliata della procedura per valutare correttamente la funzione respiratoria in consapevole, che respirano spontaneamente gli animali in maniera non invasiva. La DCP può essere utilizzato per monitorare la funzione respiratoria degli animali multipli in parallelo, nonché di identificare i cambiamenti indotti da sostanze aerosolized nel corso di un periodo di tempo scelto e in modo ripetuto. Esperimenti su topi allergici e controllo sono utilizzati nel presente documento per dimostrare l’utilità della tecnica, spiegare i parametri di outcome associato, nonché come per discutere i vantaggi ad esso correlati e le carenze. Nel complesso, il DCP fornisce letture valide e teoricamente audio che possono essere considerato attendibile per valutare la funzione respiratoria di cosciente piccoli animali sia al basale e dopo le sfide con sostanze aerosolized.

Introduction

L’uso aumentante di piccoli animali per malattie respiratorie umane di modello ha sollecitato lo sviluppo di tecniche per valutare quantitativamente le funzioni dell’apparato respiratorio in quegli animali. Attualmente, la tecnica di oscillazione forzata (UFT) è riconosciuta come l’approccio più preciso per valutare la meccanica respiratoria in piccoli animali1,2. Tuttavia, come ha dichiarato il principio di indeterminazione phenotyping, cosa si guadagna in precisione di misura con l’UFT è scambiato fuori contro una perdita in noninvasiveness3. Infatti, misure FOT vengono acquisite in condizioni altamente controllate sperimentale che necessitano di anestesia, tracheotomia o intubazione orale, nonché a ventilazione meccanica; uno scenario lontano dalla vita reale.

In situazioni in cui i requisiti sperimentali proscrivere l’uso di agenti anestetici o chiamano per poca o nessuna deviazione dalla naturale stato fisiologico dell’animale, può essere considerata doppia camera pletismografia (DCP). Come indica il nome, un programma di installazione di DCP consiste di due alloggiamenti rigide collegate costruiti per isolare ermeticamente e quanto più possibile la testa dell’animale (o naso), nella camera anteriore, dal suo torace, nel vano posteriore. All’interno dell’installazione, l’animale è cosciente e respira spontaneamente mentre essere trattenuto. Perché le pareti delle camere non è possibile espandere o ritirare, il moto dell’aria-e-out dell’animale genera un corrispondente ma opposto della forma d’onda all’interno della camera posteriore, a seguito di compressione/decompressione dell’aria circostante. La forma d’onda a causa del flusso nasale nell’alloggiamento anteriore ed in quello relativo al movimento toracico nel vano posteriore può così essere separata e catturata simultaneamente. A seconda del design del setup DCP, queste forme d’onda possono essere acquisite utilizzando un set di trasduttori di pressione o pneumotachographs rispettivamente registrare le modifiche in camera pressione o flusso d’aria-e-out delle camere come funzione del tempo. Il secondo approccio è più comune al giorno d’oggi.

Mentre la frequenza di respirazione dell’animale può essere determinato con precisione da qualsiasi tipo di tecniche di pletismografia, la situazione non è lo stesso per la determinazione del volume corrente e i relativi parametri di ventilazione correlate (ad es., ventilazione minuto, volume espiratorio, ecc.). In contrasto con la tecnica del corpo intero pletismografo (WBP), dove il volume corrente dell’animale è stimato dalla scatola segnale4,5, la tecnica DCP fornisce una valutazione accurata del volume corrente. Questo è legato all’acquisizione diretta del movimento toracico dell’animale nel vano posteriore, che sono proporzionali ai cambiamenti di volume dei polmoni durante la respirazione.

Oltre a questi precisi parametri ventilatori (ad es., volume corrente, frequenza di respirazione e ventilazione per minuto), alcuni disturbi nella forma del ciclo respiratorio possono essere utilizzati anche per indagare aspetti neuronali che governano il unità respiratoria o riflessi respiratori. Un esempio specifico di tale applicazione sarebbe la valutazione del potenziale di irritazione delle sostanze inalate sui neuroni sensoriali delle vie respiratorie superiore6. Qui, la durata di una pausa all’inizio della scadenza è determinata utilizzando un parametro chiamato pausa di fine inspirazione (EIP), noto anche come durata della frenata6. Il prolungamento di questa pausa di una sostanza irritante è associato con la chiusura della glottide dell’animale, causando un periodo misurabile di frenatura nella parte prima della scadenza6,7.

Un altro importante vantaggio del DCP è che esso fornisce due parametri convalidati e indiscussi che sono sensibili all’ostruzione del flusso d’aria. Uno è chiamato il flusso a metà-tidal volume espiratorio ed è abbreviato EF508,9,10. È il flusso d’aria a metà volume di ogni respiro delle maree durante l’espirazione. EF50 viene estratto dalla traccia flusso toracica e quindi può essere misurata senza la camera anteriore (cioè, in una configurazione testa-out). L’altra è chiamata resistenza specifica delle vie respiratorie ed è abbreviato sRaw11,12,13. La determinazione di sRaw richiede la registrazione simultanea dei flussi di nasale e toracica dell’animale come viene calcolata dal tempo di ritardo tra queste tracce separate respiratorie nel punto zero flusso al termine dell’inspirazione. La spiegazione razionale che descrive la base da cui questo ritardo si riferisce sRaw era expatiated in precedenza11. In parole povere, i cambiamenti nel volume polmonare precedono il movimento dell’aria dal momento che un gradiente di pressione deve sviluppare in ordine al flusso d’aria in auto. In un animale sano respirare tranquillamente, questo ritardo è in genere molto piccolo. Tuttavia, il gradiente di pressione è necessaria per accogliere un determinato flusso (ad esempio, un flusso sufficiente a fornire una ventilazione adeguata) è influenzato dal grado di resistenza delle vie respiratorie. Durante broncocostrizione, ad esempio, il gradiente di pressione necessari per accogliere un determinato flusso è maggiore, il che implica che l’animale deve lavorare di più per la respirazione. Una maggiore pendenza di pressione nel torace dell’animale implica anche che una maggiore porzione del flusso e out della camera posteriore è a causa della decompressione/compressione dell’aria all’interno del torace, che è la parte della totale espansione/retrazione toracica che è fuori fase con il flusso nasale. La resistenza aumentata a causa di broncocostrizione aumenterà così il ritardo tra la parte posteriore e gli alloggiamenti anteriori e quindi aumenta sRaw. Il gradiente di pressione che spinge il flusso d’aria e out del polmone è anche influenzato dal volume iniziale gas toracici (TGV). Presso un TGV maggiore ad esempio, l’espansione/retrazione del torace necessaria per generare un dato gradiente di pressione è maggiore (semplicemente perché lo spostamento di volume che è necessaria per generare un dato gradiente di pressione è maggiore), che implica anche che la animale deve lavorare di più per la respirazione. Ancora una volta, questi spostamenti extra toracici sono quelli richiesti da decomprimere/comprimere aria nel torace e sono così fuori fase con il flusso nasale. Così, un TGV aumento aumenterà anche il ritardo tra le camere e quindi aumenta sRaw. Come si può vedere, broncocostrizione sia aumentata TGV causare uno sforzo più importante per aspirare l’aria e out del polmone. Questo è, in sostanza, il significato fisiologico di sRaw. Rappresenta il lavoro necessario per la respirazione5,14.

Quindi è importante capire che due distinti fattori influenzano sRaw: resistenza delle vie aeree e TGV. Infatti, sRaw può essere espresso come il prodotto della resistenza delle vie aeree e TGV11. Animali coscienti possono modificare loro TGV a volontà, per adattare la loro ventilazione di un determinato ambiente. In tali condizioni, dove lo stato fisiologico naturale dell’animale è inalterato, così è impossibile discernere se un cambiamento in sRaw deriva da un’alterazione nella resistenza delle vie aeree, da un cambiamento in TGV o da un mix dei due. Pertanto, si raccomanda di integrare la valutazione di DCP con ulteriori misurazioni invasive della meccanica respiratoria e/o volumi polmonari, quali quelli forniti dall’UFT1,15.

Ad oggi, il DCP è stato utilizzato in varie applicazioni di ricerca. La tecnica può essere utilizzata con o senza la testa camera per quantitativamente e valutare con precisione l’effetto di varie sostanze, quali gli agenti farmaceutici, allergeni, sostanze irritanti o altri mediatori, sulla funzione respiratoria in animali coscienti di piccoli 16,17,18. La camera anteriore può essere utilizzata anche come una camera di esposizione a sostanze aerosolized o vari gas concentrazioni (ipossia, ipercapnia, ecc.)19. Convenientemente, essa permette di misurare simultaneamente gli effetti acuti di queste esposizioni. Infatti, uno degli usi comuni del DCP è di valutare il grado di risposta al methacholine aerosolized in diversi modelli di malattie respiratorie20,21,22,23, 24 , 25.

Anche se la tecnica DCP è apparentemente semplice, alcune sfide pratiche potrebbero scoraggiare gli utenti inesperti o compromettere l’accuratezza e la riproducibilità dei risultati. Il presente documento fornisce una descrizione dettagliata delle procedure consigliate per funzione respiratoria con successo record di DCP in topi cosciente, sobri, spontaneamente respirante. La descrizione è specifica per l’attrezzatura indicata (si prega di fare riferimento alla Tabella materiali). L’utilità e il valore del DCP è anche dimostrato in un modello comune di infiammazione allergica polmonare in due ceppi di topi testati al basale e in risposta al methacholine aerosolized.

Protocol

Le procedure seguenti sono state approvate dal Quebec cuore e polmone Istituto animale cura Comitato conformemente agli orientamenti del Consiglio canadese su cura (CCAC). 1. preparazione Studio (Critico) Prima di eseguire qualsiasi esperimento, ottenere le approvazioni appropriate (ad es., IACUC) e corsi di formazione (ad es., gestione degli animali). Familiarizzare con le attrezzature e il software operativo. Leggere il manuale d’uso e, se necessario, creare un file di configurazione per definire il numero di siti, segnali, analizzatori e parametri di input.Nota: Assicurarsi di selezionare una frequenza di campionamento alta (2 KHz). Configurare le impostazioni di analizzatori per i parametri di interesse. Seleziona Tuning dalla barra degli strumenti e quindi analizzatori. Regolare la soglia di flusso a un valore che separa correttamente i soffi (mouse: 0,5 mL/s) e optare per Ti + Te calcolare il tasso di respirazione. Impostare un valore per la pressione barometrica (760 mm Hg) e specificare la deviazione massima del volume inspiratorio/espiratorio per un soffio essere considerati validi (mouse: 20%). Fare clic su impostazione nel campo parametri calcolati per regolare i limiti di accettazione.Nota: Le impostazioni seguenti sono state utilizzate per gli esperimenti descritti del mouse: tempo di ispirazione, 50 a 170 ms; Data di scadenza, 40 a 180 ms; frequenza della respirazione, 30 a 450 bpm; resistenza specifica delle vie respiratorie, 0 a 15 cmH2O·s; flusso di midexpiratory con una precisione di almeno 3 cifre decimali. Una volta completato, selezionare Applica e Chiudi per chiudere la finestra di dialogo. Dal menu della barra strumento, andare su Tuning nuovamente, quindi deposito di fissare un tasso di deposito di dati desiderato. Fare clic su Applica e Chiudi per chiudere la finestra.Nota: Mediamente ogni 10 s viene in genere utilizzato. Creare un protocollo all’interno del software operativo per definire una sequenza di comandi e l’intervallo di tempo desiderato per ciascuno di essi. Un esempio è mostrato nella Figura 1. Se l’esperimento prevede la somministrazione di una sostanza da aerosol, preparare le soluzioni appropriate e diluizioni secondo le concentrazioni da testare. Animale Lavorare in una zona tranquilla lontana dal vano di alloggiamento. Consentire agli animali di adattarsi al cambiamento dell’ambiente. Pesare gli animali e selezionare il formato di ritenuta appropriata. (Critico) Acclimatare gli animali per la guida e le procedure prima dell’inizio dell’esperimento. A seconda del design sperimentale, più sessioni di acclimatazione di aumento della durata (per esempio, 5-30 min) può essere necessaria.Nota: Animali che non acclimatare dovrebbero essere rimosso dallo studio. Ad ogni sessione di acclimatazione, inserire l’animale all’interno del dispositivo di ritenuta, procedendo dall’apertura posteriore; tenendo il dispositivo in posizione verticale può essere utile. Una volta che l’animale è in posizione, inserire il pistone posteriore e delicatamente bloccarlo in posizione senza applicare una forza eccessiva. (Critico) Controllare visivamente che l’animale respira normalmente. Se necessario, è possibile regolarne la posizione spostando il meccanismo di bloccaggio. Assicurarsi che le narici dell’animale sono sporgenti di fuori del cono di naso con il muso che si riposano contro le pareti interne del dispositivo di ritenuta. Rimuovere il pannello posteriore dell’alloggiamento toracica, inserire il dispositivo di ritenuta contenente l’animale attraverso la gomma apertura nel vano toracica e chiudere la camera. Attaccare la testa camera e fornire un flusso di sbieco. Utilizzare un flusso di 0,5 L/min per un mouse. Permettere all’animale di rilassarsi per 5 min. Una volta che l’animale è calmo, avviare la registrazione dei segnali di flusso nasale e toracica. Verificare sullo schermo del computer che le tracce sono lisce e consentono di visualizzare un modello di respirazione regolare; vedere l’esempio in Figura 2.Nota: Se il protocollo prevede la somministrazione di aerosol di una sostanza, una sfida Salina può essere incluso nella procedura di acclimatazione. Alla fine di ogni sessione, rimuovere l’animale dalla camera del toracica e il dispositivo di ritenuta e restituirlo al suo alloggiamento cage e la camera. Attrezzature Il giorno dell’esperimento, avviare una sessione sperimentale e caricare il file di configurazione appropriato.Nota: Verificare che contenga il protocollo desiderato per l’esperimento. Andare a correre nel menu della barra strumento. Immettere le informazioni dell’animale e l’esperimento. Una volta fatto, fare clic sul pulsante Esegui nella parte inferiore della finestra. Procedere con la calibrazione del sistema. Ogni sito di calibrare e segnale di ingresso separatamente. Accendere il generatore di flusso bias, collegarlo alla camera di testa tramite un pezzo di tubo e regolare la portata. Chiudere l’apertura superiore dell’alloggiamento della testa con un berretto. Rimuovere il pannello posteriore dell’alloggiamento toracica, inserire saldamente lo strumento di calibrazione all’interno della gomma apertura fra la testa e l’alloggiamento del corpo per creare una chiusura ermetica. Chiudere, quindi fissare nuovamente il pannello posteriore dell’alloggiamento toracica. Verificare che la porta sul lato della camera toracica è limitata. Dal menu della barra strumento software, andare al Tuning e quindi calibrare. Vai a Input 1 (toracica) e selezionare Calibrate per avviare la finestra di dialogo calibrazione per il segnale di flusso toracica. (Critico) Verificare che i parametri elencati nella finestra di dialogo di calibrazione visualizzare le impostazioni appropriate, cioè, lo stress fisico applicato valore basso: 0; Stress fisico applicato ad alto valore:-20 mL/s; Campioni: integrare. Una volta fatto, clicca in basso nella finestra esempi . Verificare che il segnale generato è costante attraverso la finestra di visualizzazione e quindi fare clic su Chiudi. Collegare una siringa 20 mL-attraverso la porta laterale della sezione toracica utilizzando un connettore di plastica e un pezzo di tubo. (Critico) Selezionare in alto nella finestra esempi e iniettare immediatamente 20 mL di aria nella camera per un periodo di 2 s ad un flusso più costante possibile. Verificare che il segnale generato completamente all’interno della finestra di visualizzazione. Utilizzare l’icona della freccia per verificare se il segnale è centrata e simmetrica intorno della linea dello zero. Quindi, fare clic su Chiudi. Rimuovere qualsiasi offset da zero facendo clic su rimuovere AC offset nella finestra esempiNota: La calibrazione di valore alto può essere rifatto, se necessario. Verificare che la risultante In scala ingresso gamma sia all’interno della gamma raccomandata (mouse: ±280 a ±420 mL/s). (Critico) Ripetere la procedura di calibrazione, se i valori sono compresi nell’intervallo accettabile. Calibrare la camera di testa in un modo simile come la camera toracica (passo 1.3.3.6). Questa volta, selezionare Input 2 (nasale).Nota: (Importante) Il valore per stress fisico applicato alto valore deve essere impostato su + 20 mL/s. Questo cambierà la polarità del flusso nella camera anteriore in relazione la camera posteriore. Quindi, quando l’animale sta respirando, i segnali di due flusso quasi siano in fase, a parte il ritardo utilizzato per calcolare sRaw. 2. misure di funzione polmone Pesare gli animali e prendere nota del loro peso corporeo. Inserire l’animale all’interno del dispositivo di ritenuta e posizionarlo all’interno della camera di pletismografo toracica (passaggi 1.2.3.1 per 1.2.3.5). Permettere all’animale di rilassarsi per almeno 5 min. Avviare il protocollo di comandi selezionando il primo passo e quindi fare clic su Execute. Controllare sullo schermo del computer che la respirazione dell’animale segnali sono regolari e liscio (Figura 2). Il software Visualizza automaticamente i parametri calcolati su una base di respiro per respiro. Verificare che i parametri dell’animale sono stabili. Registrare il modello di respirazione sotto condizioni di base per circa 10 minuti. Per i protocolli che comprendano la somministrazione della sostanza in esame da aerosol, procedere come segue: Regolare il ciclo in tempo e il dovere di nebulizzatore, come richiesto.Nota: Negli esempi hanno dimostrati in questo articolo, il nebulizzatore è stato operato presso un 5% duty cycle per 10 s. Eseguire una sfida su veicoli (ad es., soluzione fisiologica) e registrare la risposta. Se necessario, esporre l’animale a aumento delle concentrazioni della sostanza in esame modificando la concentrazione nel nebulizzatore in escalation passaggi (ad esempio, raddoppiando le concentrazioni). Registrare la risposta dopo ogni somministrazione. Alla fine della sessione sperimentale, se non avviene automaticamente, interrompere la registrazione e restituire l’animale gabbia di alloggiamento e camera. Se necessario, selezionare Esegui dal menu della barra di strumento per eseguire un’altra sessione sperimentale. Tra le sessioni, gli alloggiamenti pletismografo e sciacquare il nebulizzatore con acqua.Nota: L’uso di alcol può causare danni irreversibili per il pletismografo. Se lo studio implica valutazioni ripetute nel tempo, ripetere la sequenza intera misura presso ogni timepoint selezionate.Nota: Saggiamente si raccomanda di integrare lo studio con alcune misurazioni precise della meccanica respiratoria e/o polmone volumi1,15. 3. analisi dei dati Nota: Il software automaticamente Salva il file sperimentale ed Esporta i parametri registrati quando viene chiusa la sessione sperimentale. Calcolare una media della linea di base per i parametri di interesse per ogni gruppo sperimentale ed animale.Nota: tabella 1 elenca una serie di parametri tipici, classificati basata sul tipo di informazioni che forniscono. Se del caso, valutare l’effetto della sostanza aerosolized studiata sui parametri di interesse a ciascuna concentrazione utilizzando un punto specifico (ad esempio, valore massimo o minimo), una media o il corso a tempo pieno; può anche essere considerata una normalizzazione alla linea di base. Riportare i risultati utilizzando i mezzi di gruppo e gli errori in una tabella o un formato grafico. Analizzare statisticamente i risultati.Nota: Nello studio presente, ANOVAs bidirezionale con ripetute misure sono stati utilizzati per valutare l’effetto di methacholine, l’allergene – acaro della casa-polvere (HDM) – e la loro interazione su diversi display DCP (sRaw ed EF50), nonché su diverse letture di UFT (R,N, G e H), in entrambi i ceppi di topi. Test di confronto più di sidak sono stati poi utilizzati per determinare le concentrazioni di methacholine in cui i topi allergici differiscono dai topi di controllo. Gli stessi test sono stati utilizzati per valutare l’effetto dei giorni, HDM e loro interazione alla linea di base (cioè, prima di methacholine) su letture di ostruzione delle vie respiratorie (sRaw ed EF50) e del modello di ventilazione (BF, TV, MV ed EIP). Le correlazioni di Pearson sono state usate per valutare le correlazioni tra sRaw ottenuti con la DCP e RN ottenuti con l’UFT. Tutte le analisi statistiche e grafici sono stati eseguiti utilizzando software statistico standard alternativo (ad es., GraphPad Prism). p ≤ 0,05 è stato considerato sufficiente per respingere l’ipotesi di null.

Representative Results

I risultati delle valutazioni ripetute della funzione respiratoria di DCP, eseguita in condizioni basali in tre giorni consecutivi (giorni 12, 13 e 14 del protocollo illustrato nella Figura 1) nel controllo e allergici topi BALB/c, sono mostrati in figura 3 . Inclusi i parametri che sono stati selezionati per valutare il modello di respirazione respirazione frequenza (Figura 3A), tidal volume (Figura 3B), ventilazione minuto (Figura 3) e la pausa di fine inspirazione (Figura 3D). I parametri utilizzati per valutare l’ostruzione delle vie respiratorie erano EF50 (Figura 3E) e sRaw (Figura 3F). I risultati di ogni parametro selezionato erano stabili nel corso di questi tre giorni consecutivi in entrambi i gruppi, con nessun effetto apparente causata da infiammazione allergica. Il grado di risposta al methacholine è stato valutato da DCP in giorni successivi (giorni 12, 13 e 14 del protocollo illustrato nella Figura 1) in topi BALB/c allergici sia di controllo. I risultati, illustrati nella Figura 4, visualizzare le modifiche nei due parametri che sono sensibili all’ostruzione delle vie respiratorie, vale a dire sRaw (Figura 4A, B e C) ed EF50 (Figura 4, E e F). Come previsto, concentrazioni incrementali del methacholine sRaw è progressivamente aumentato e diminuito progressivamente EF50. Queste risposte sono state rafforzate da infiammazione allergica, soprattutto alla concentrazione finale testata, che attesta la presenza di hyperresponsiveness. I risultati dimostrano anche che il grado esagerato di reattività è stato limitato al primo giorno (giorno 12), come non è stato osservato durante le due valutazioni successive (vale a dire, ai giorni 13 e 14). I risultati della valutazione della meccanica respiratoria dall’UFT, eseguita l’ultimo giorno del protocollo sperimentale (giorno 15; Figura 1) controllo sia allergici topi BALB/c, sono illustrati nella Figura 5. Questi esperimenti sono stati inclusi nello studio per integrare le valutazioni di DCP. L’UFT è riconosciuto come un approccio più preciso per valutare la funzione respiratoria2. Uno dei suoi punti di forza è che esso fornisce approfondimenti topografici su quali siti del polmone (conducendo airways contro airways periferico e tessuto polmonare) sono interessati dagli interventi di testata (ad es., allergene e methacholine). La metodologia consigliata per valutare la meccanica respiratoria con l’UFT è stato descritto in precedenza1. Qui, tre UFT parametri sono stati utilizzati per descrivere i cambiamenti nella meccanica respiratoria indotta da methacholine e l’infiammazione allergica. Questi parametri inclusi: resistenza 1-newtoniano (RN; Figura 5A), un parametro per il quale i cambiamenti nel valore soprattutto riflettere variazioni nella resistenza delle grandi vie aeree di conduzione; 2-tessuto smorzamento (G; Figura 5B), un parametro per il quale i cambiamenti nel valore soprattutto riflettere variazioni nella resistenza del tessuto; e 3-tessuto elastanza (H; Figura 5), un parametro per il quale i cambiamenti nel valore soprattutto riflettere variazioni in tessuto rigidità2. Come previsto, c’era un aumento in ciascuno di questi parametri in risposta alle concentrazioni incrementali di methacholine. Coerente con sRaw ed EF50 risultati ottenuti con la DCP del giorno precedente (giorno 14; Figura 1), i cambiamenti in RN indotta da methacholine (Figura 5A) erano comparabili tra il controllo e i topi allergici. Infatti, i valori di sRaw al giorno 14 correlata con i valori di RN al giorno 15 (Figura 5). L’aumento in H indotta da methacholine era inoltre simile tra il controllo e i topi allergici (figura 5B). Tuttavia, l’aumento di methacholine-indotto in G era significativamente maggiore nei topi allergici (Figura 5). Questo risultato dimostra la presenza di un fenotipo hyperresponsive persistenti nei topi allergici al giorno 15, che non è stata rilevata dalle valutazioni DCP eseguite nei due giorni precedenti. L’intero studio è stato ripetuto con topi C57BL/6. I risultati delle successive valutazioni DCP sRaw, ai giorni 12, 13 e 14 del protocollo (Figura 1) e della valutazione di RN, UFT al giorno 15, sono riportati nella Figura 6. In quel ceppo specifico del mouse, la risposta di methacholine esagerata osservata nei topi allergici è stata mantenuta durante i tre giorni consecutivi (Figura 6A, Be C). Questo fenotipo hyperresponsive fu anche raffigurato con l’UFT al giorno 15 da un aumento in RN indotta di methacholine che era più pronunciata nei topi allergici (Figura 6E). Questi erano in netto contrasto con i risultati ottenuti con i topi BALB/c, dove un progressivo declino del hyperresponsiveness accaduto da giorni 12-14 (Figura 4) e una mancanza di differenza nell’aumento indotto da methacholine RN è stata osservata al giorno 15 (Figura 5A). Insieme, questi risultati hanno indicato un effetto variabili nel tempo dell’allergene sulla risposta methacholine-indotta tra i due ceppi di topi. D’importanza, questa differenza di ceppo è stata rappresentata da sia il DCP e l’UFT. Concordemente, i valori di sRaw misurata dal DCP al giorno 14 correlati con i valori di RN valutati dall’UFT al giorno 15 (Figura 6F), in quanto è stato osservato con i topi BALB/c (Figura 5). Figura 1 . Protocolli utilizzati per indurre l’infiammazione allergica polmonare e per valutare il grado di risposta al methacholine. Questo studio è stato condotto su topi C57BL/6 di 7 per 9 settimane di età e femmina BALB/c. La sequenza degli interventi effettuati durante l’intero studio è mostrata nel pannello (A). Metà dei topi è stato esposto a 50 µ g di Estratto di acaro della casa-polvere (HDM) per via nasale su 14 giorni consecutivi per indurre l’infiammazione allergica polmonare. L’altra metà era esposto a saline e utilizzata come controllo. Funzione respiratoria è stata valutata da doppia camera pletismografia (DCP) in tre occasioni separate (giorni 12, 13 e 14; cerchi neri) dopo una sessione di acclimatazione (giorno 11; cerchio grigio) che comprendeva una sfida con soluzione fisiologica aerosolized. Durante ogni sessione, funzione respiratoria basale e la risposta al methacholine sono state valutate utilizzando il protocollo automatizzato, mostrato nel pannello (B). Al giorno 15, una valutazione invasiva della meccanica respiratoria con la tecnica di oscillazione forzata (UFT) è stata effettuata come descritto in precedenza1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 . Segnali di flusso rappresentativo da un sano topo BALB/c. I pannelli mostrano tracce di registrazione tipico ottenute mediante pletismografia doppia camera in un mouse di controllo in condizioni basali. Toracica flusso viene visualizzato nel pannello superiore e flusso nasale è indicato nel riquadro in basso. I valori negativi sono durante l’inspirazione e i valori positivi sono durante l’espirazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 . Ripetute valutazioni della funzione respiratoria in cosciente topi BALB/c. Funzione respiratoria basale è stata valutata da pletismografia a doppia camera (DCP) nei topi allergica (simboli solido) e controllo (aperti simboli) nei giorni 12, 13 e 14 del protocollo illustrato nella Figura 1. I parametri DCP utilizzati per valutare la funzione respiratoria inclusa respirazione frequenza in (A), volume corrente (TV) (B), ventilazione minuto (MV) (C), fine inspiratoria mettere in pausa (EIP) a (D), portata a metà-tidal volume espiratorio ( EF50) in (E) e resistenza specifica delle vie respiratorie (sRaw) a (F). I valori di frequenza e TV, MV, sRaw EIP di respirazione per ogni mouse erano che i valori medi registrati oltre 1,5 min. Il valore di EF50 era il minimo valore ottenuto durante questo periodo di registrazione. I risultati sono presentati come gruppo significa ± deviazione standard (n = 5/gruppo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . Prova di bronchoprovocation di Methacholine in coscienti topi BALB/c. Methacholine reattività è stata valutata da doppia camera pletismografia (DCP) nei topi allergica (simboli solido) e controllo (aperti simboli) nei giorni 12, 13 e 14 del protocollo illustrato nella Figura 1. I parametri DCP utilizzati per valutare la risposta incluso resistenza specifica delle vie respiratorie (sRaw) in (A) attraverso (C) e flusso a metà-tidal volume espiratorio (EF50) (D) fino a (F). La bronchoprovocation è stata eseguita da aerosolizing methacholine nella camera testa di DCP per 10 s a concentrazioni incrementali. La risposta è stata monitorata durante 1,5 min dopo ogni operazione di concentrazione. Il valore di sRaw per ogni mouse a ciascuna concentrazione era che il valore medio registrato oltre 1,5 min. Il valore di EF50 era il minimo valore ottenuto durante questo periodo di registrazione. I risultati sono presentati come gruppo significa ± deviazione standard (n = 5/gruppo). Il simbolo di asterisco * indica una differenza statisticamente significativa (p 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 . Valutazione invasiva della meccanica respiratoria nei topi BALB/c. Meccanica respiratoria al basale e in risposta al methacholine è stata valutata mediante la tecnica di oscillazione forzata (UFT) il giorno 15 del protocollo illustrato nella Figura 1. Il controllo (aperti simboli) e i topi allergica (tinta simboli) erano gli stessi di quelli testati da doppia camera pletismografia (DCP) nei giorni 12, 13 e 14. I parametri utilizzati per valutare la meccanica respiratoria erano resistenza newtoniano (RN) (A), del tessuto elastanza (H) (B) e (G) di smorzamento (C) del tessuto. Il bronchoprovocation è stato effettuato da concentrazioni incrementali del methacholine direttamente nel tubo endotracheale di topi anestetizzati, corsia, paralizzati e ventilati meccanicamente in posizione supina di nebulizzazione. La risposta è stata monitorata durante 5 minuti dopo ogni operazione di concentrazione. Il valore per ogni parametro per ogni mouse a ciascuna concentrazione era il valore di picco ottenuto durante questo periodo di registrazione. I risultati sono presentati come gruppo significa ± deviazione standard (n = 5/gruppo). Pannello (D) viene illustrata la correlazione tra resistenza specifica delle vie respiratorie (sRaw) misurata da DCP il giorno 14 e RN misurato dall’UFT il giorno 15. I simboli aperti rappresentano i valori al basale e i simboli solidi rappresentano valori massimali al più alta concentrazione di methacholine testato per il controllo (cerchi) o i topi allergica (piazze). L’inserto Mostra il coefficiente di determinazione (r2). Il simbolo di asterisco * indica una differenza statisticamente significativa (p ≤ 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 . Funzione respiratoria e meccanica respiratoria invasiva in topi C57BL/6. Resistenza specifica delle vie respiratorie (sRaw) è stata valutata da doppia camera pletismografia (DCP) al basale e in risposta al methacholine nei topi allergica (simboli solido) e controllo (aperti simboli) nei giorni 12 (A), 13 (B) e 14 (C) del protocollo è illustrato nella Figura 1. Resistenza newtoniano (RN) al basale e in risposta al methacholine sono stati valutati mediante la tecnica di oscillazione forzata (UFT) il giorno 15 (D). I bronchoprovocations sono stati effettuati come descritto in Figura 4 e Figura 5 per il DCP e l’UFT, rispettivamente. I risultati sono presentati come gruppo significa ± deviazione standard (n = 5/gruppo). Pannello (E) Mostra la correlazione tra sRaw misurata da DCP il giorno 14 e RN misurato dall’UFT il giorno 15. I simboli aperti rappresentano i valori al basale e i simboli solidi rappresentano valori massimali al più alta concentrazione di methacholine testato per il controllo (cerchi) o i topi allergica (piazze). L’inserto Mostra il coefficiente di determinazione (r2). Il simbolo di asterisco * indica una differenza statisticamente significativa (p ≤ 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Parametro Unità Descrizione Informazioni F BPM Frequenza respiratoria Modello di ventilazione TV mL Volume corrente MV mL Ventilazione per minuto Ti MS Tempo inspiratorio Te MS Tempo espiratorio PIF mL/s Picco di flusso inspiratorio PEF mL/s Picco di flusso espiratorio EV mL Volume espiratorio NTV mL Volume respiratorio nasale NEV mL Volume espiratorio nasale EIP MS Pausa inspiratoria fine EEP MS Pausa espiratoria fine dT MS Tempo di ritardo Ostruzione del flusso d’aria sRaw cmH2O·s Resistenza specifica delle vie respiratorie sGaw 1/cmH2O·s Conduttanza specifica delle vie respiratorie EF50 mL/s Flusso a metà-tidal volume espiratorio SR % Tasso di successo Controllo di qualità N Numero di respiri validi Tabella 1. Elenco dei parametri tipici ottenuti da doppia camera pletismografia. I parametri sono stati raggruppati secondo la natura delle informazioni che forniscono durante una valutazione della funzione respiratoria. Vantaggi Limitazioni · Animali coscienti · Necessità di controllare l’ambiente circostante · Parametri di accurata ventilazione · Preventiva acclimatazione degli animali · Indici indiscussi dell’ostruzione del flusso d’aria (sRaw, EF50) · Requisito per separare ermeticamente i flussi nasali e toracici · Adattabile a vari formati di animali e specie · Variabilità di assoluto valore per alcuni parametri di outcome · Utilizzato in molte applicazioni di ricerca · sRaw non una vera misura di resistenza · Tecnica semplice · Presenza di vie aeree superiori · Sensibile ai cambiamenti · Integrando le misure con una valutazione invasiva Tabella 2. Elenco di vantaggi e limitazioni associate a doppia camera pletismografia. Doppia camera pletismografia Tecnica di oscillazione forzata Stato dell’animale di coscienza Inalterato Anestetizzati (e solitamente paralizzato) Posizione dell’animale Montante Supina Accessibilità dell’animale Confinati all’interno della camera Accessibile Integrazione degli animali per il dispositivo di misurazione Sigillo del naso o sul collo Intubazione orale o di tracheotomia Albero delle vie respiratorie dell’animale Intatto Parziale – segmento delle vie respiratorie superiore escluso (conduce cioè nasale, faringe e laringe) Volume polmonare in cui vengono ottenuti i parametri di outcome Variabile – spontanea volume adottato dall’animale Standardizzata – utilizzando manovre di reclutamento controllata e pressione estremità-espiratoria positiva. Frequenza alla quale vengono valutati i parametri di outcome Variabile – frequenza di respirazione spontanea adottato dall’animale Controllato – usando predefiniti di forme d’onda a frequenze specificate Contributo dal segmento delle vie respiratorie superiore ai parametri di risultato Deve essere previsto Aggirato Sito di consegna di aerosol All’interno della camera di testa Direttamente nella trachea Effetto del segmento delle vie respiratorie superiore sulla dose inalata / modello di deposizione di aerosol Deve essere previsto Ha impedito Capacità di rilevare il cambiamento – sulla base dei risultati del presente studio Osservato Osservato Variabilità intrinseca della tecnica – sulla base dei risultati del presente studio Fluttuazione del coefficiente di variazione per sRaw al basale: 7,5-20,6% Fluttuazione del coefficiente di variazione per RN al basale: 3.6-13,4% Tabella 3. Confronto tra le tecniche di oscillazione forzata e pletismografia a doppia camera.

Discussion

La capacità di misurare la funzione polmonare in animali coscienti è chiaramente garantita nella ricerca delle vie respiratorie. In generale, il DCP è un approccio interessante per valutare la funzione di ventilazione dell’apparato respiratorio in conscio e animali26che respirano spontaneamente. Più specificamente, il DCP, o la sua variante di testa-out, spesso colpisce un giusto equilibrio tra la qualità delle informazioni fornite e il livello desiderato di invasività3 (tabella 2). La tecnica può essere adattata alle varie specie (ad es., topo, ratto, cavia) o animali di dimensioni e può essere utilizzata in molte applicazioni di ricerca. È particolarmente utile valutare numerosi animali in una sola volta in un disegno di studio parallelo, per monitorare la funzione respiratoria in modo ripetuto e per catturare la cinetica di una risposta nel tempo. Inoltre, la tecnica è semplice e può essere imparata in tempi relativamente brevi. Nel presente documento, un protocollo che impiegano misure di DCP in topi è stato utilizzato come un esempio per descrivere gli aspetti pratici di questo trattenuto tecnica di pletismografia pure come per discutere i passaggi critici e relativi risultati.

Quando si lavora con animali coscienti, è essenziale per controllare le condizioni dell’ambiente circostante (ad es., camera tranquilla con un numero limitato di persone o attività) al fine di generare risultati riproducibili. Poiché i dispositivi sono disponibili in diverse dimensioni, è importante iniziare con la dimensione appropriata in modo che i movimenti respiratori sono imperturbabile. È anche utile e spesso necessario per acclimatare gli animali per il set-up sperimentale e procedure, come è affermato nei topi che trattenente colpisce la frequenza di respirazione12. A seconda del disegno sperimentale o condizioni, possono essere necessari più sessioni di durate incrementale. Infine, lasciando il tempo all’inizio di un esperimento per gli animali regolare il cambio di camera e manipolazione necessaria è una semplice considerazione che si è rivelata efficace per garantire che il pattern respiratorio è sempre regolare e rilassata al basale. Lavoro in condizioni dove gli animali sono confortevoli, ben adattato e calma sarà anche vantaggioso in termini di qualità e la variabilità del risultato. Inoltre limita qualsiasi rilascio indotto da stress della catecolamina, che può aumentare il calibro delle vie aeree e attenuare una broncocostrizione indotta.

È importante capire che c’è una necessità di separare il più ermeticamente possibile dei flussi nasali e toracici. A seconda del sistema o specie studiate, il meccanismo di tenuta può variare nella forma anche come efficacia. In DCP abbiamo descritto nel presente documento, il sigillo viene creato tra il muso dell’animale e il dispositivo trattenente. Nel valutare la funzione respiratoria di DCP, è anche essenziale per fornire un flusso di sbieco sufficiente e continuo, come una diminuzione del livello di ossigeno disponibile per l’animale si tradurrà in effetti significativi. Prendendo in considerazione il benessere dell’animale per il dispositivo di ritenuta limita la propensione per perdite d’aria creato da agitazione e quindi massimizza la qualità dei dati. Confermarsi, una rottura nella guarnizione si tradurrà in DataSet rifiutati o una sottovalutazione di alcuni parametri.

Inoltre per abilitare la registrazione separata dell’ingresso del flusso nasale, la camera di testa in genere viene utilizzata per esporre l’animale a sostanze aerosolized. Come illustrato in questo articolo, questo può essere utilizzato per eseguire un test di bronchoprovocation per illustrare diversi gradi di reattività. In tali esperimenti, regolazione dell’intervallo di concentrazioni testate possono essere necessari a seconda della specie, ceppo o sesso degli animali studiati. Come precedentemente dimostrato8,9,10,27, i risultati attuali indicano che le alterazioni indotte dalla methacholine sRaw ha correlato bene con misurazioni di UFT invasive della resistenza delle vie respiratorie. I risultati dimostrano anche che la tecnica DCP non è sensibile come l’UFT per la sua capacità di rilevare la disfunzione respiratoria e di individuare una risposta alterata localizzata entro i compartimenti inferiori del polmone (tessuto polmonare e/o delle piccole vie aeree periferiche) . Poiché le vie aeree dell’animale sono intatte, la presenza di vie aeree superiori, che rappresenta la parte più grande della resistenza respiratoria totale a flusso d’aria28, possa influenzare la distribuzione di aerosol e la deposizione in aggiunta per smorzare il contributo da le vie aeree inferiori per una misurazione. La tabella 3 riassume altre differenze tra la tecnica DCP e l’UFT. Infine, mentre sarebbe teoricamente possibile stimare la resistenza delle vie respiratorie totale dell’animale (compresi le vie aeree superiori) da una misurazione di sRaw, è generalmente consigliabile per completare la valutazione di DCP con una tecnica di misurazione invasiva come l’UFT29 per ottenere misurazioni dirette di dettagliata meccanica respiratoria. A seconda degli obiettivi dello studio, le misure di resistenza delle vie respiratorie superiore possono anche essere considerate30,31,32.

Conclusione 
A causa del suo limitato grado di invasività, la DCP è una tecnica che può soddisfare un bisogno importante nella ricerca delle vie respiratorie. È in grado di fornire accurate letture di modello di ventilazione in animali coscienti in concomitanza con alcuni indici indiscussi dell’ostruzione del flusso d’aria. Le informazioni ottenute che integrano anche veramente da metodi più dilaganti.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SML è supportato da una borsa di studio dalla istituti canadesi di ricerca di salute, MG è supportato da una borsa di studio dalla rete salute respiratoria della FRQS (Fonds de recherche du Québec – Santé) e YB è uno studioso di ricerca da FRQS.

CONTRIBUTO DEGLI AUTORI
Tutti gli autori hanno contribuito alla concezione del manoscritto e/o il video. SML e LD ha raccolto i dati. SML, LD, YB, DM, DB e AR ha contribuito all’analisi dei dati, la generazione di figure e scrittura del manoscritto. YB, AR, KL e MG sono stati coinvolti nella preparazione dello script dei video. La commedia fu interpretata da YB, KL e MG.

Materials

Acetyl-β-methylcholine chloride  Sigma-Aldrich A-2251 Methacholine
Phosphate buffered saline Multicell 311-506-CL PBS 10X
House dust mite extract GREER 290902 HDM 
DCP complete system  SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
iox software  SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
Aerogen Aeroneb nebulizer  SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
flexiVent FX complete system  SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
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Mailhot-Larouche, S., Deschênes, L., Lortie, K., Gazzola, M., Marsolais, D., Brunet, D., Robichaud, A., Bossé, Y. Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography. J. Vis. Exp. (137), e57778, doi:10.3791/57778 (2018).
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