시 냅 스에서 사이클링 하는 FM 염료: 높은 칼륨 도발은, 전기 및 Channelrhodopsin 자극을 비교

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로 (NMJ) glutamatergic 냅 모델 아름 답게 특징은 시 냅 스 형성 유전자 섭¹의 광대 한 스펙트럼과 기능을 공부 하 고 사용 되었습니다. 여러 축 삭 분 지, 각각 많은 확대 시 냅 스 boutons 모터 신경 맨끝에 의하여 이루어져 있다. 이 널찍한 varicosities (최대 5 µ m 직경에서) neurotransmission 기계, 균일 한 glutamatergic 시 냅 스 소포를 포함 하 여 모든 포함 (SVs; ~ 40 nm 직경에서) cytosolic 예비에 쉽게 releasable 풀². 이 소포는 연 접 원형질 막 퓨전 사이트 활성 영역 (AZs), 어디 exocytosis 트랜스에 대 한 조미료 신경 전달 물질 방출을 중재에 도킹-시 냅 스 통신. 그 후, SVs는 반복된 엑 소/endocytosis 사이클 키스 실행 재활용 또는 clathrin 중재 된 endocytosis (CME)를 통해 원형질 막에서 검색 됩니다. Drosophila NMJ은 쉽게 접근 가능 하 고 모두 분리 및 SV 주기 돌연변이 적합. 앞으로 유전 스크린을 사용 하 여, 새로운 돌연변이 SV 사이클³에 대 한 중요 한 새로운 유전자의 식별을 끌고있다. 또한, 이미 알려진된 유전자로 시작 하는 역 유전 접근은 돌연변이 고기⁴사이클의 주의 설명을 통해 새로운 SV 사이클 메커니즘의 해명에 이르렀다. Drosophila NMJ 광학 트랙 소포 neurotransmission 동안 순환 하는 방법을 통해 SV endocytosis 및 exocytosis 메커니즘을 해 부에 대 한 실험 시 냅 스 준비로 거의 이상적 이다.

다양 한 형광 마커 중 역학, 소포의 시각적 추적 허용 하지만 가장 다재 다능 한 마오, F., 동부 표준시 알에 의해 처음 합성 FM 염료 아날로그. ⁵. FM 염료는 친수성 머리와 스펙트럼 속성 부여 중앙 지역으로 향기로운 반지를 통해 연결 된 질 성 꼬리를 포함 하는 구조적으로. 이러한 styryl 염료 역 막에 분할 할 하지 ‘플립플롭’ 막 전단지 사이 고 그래서 결코, cytosol에서 무료 고 물⁵보다 훨씬 더 막에 형광. 지질 bilayer에 가역 삽입 형광⁶에 40-fold 증가 발생합니다. 신경 시 냅 스에서 클래식 FM 염료 라벨 실험 SV endocytosis 통해 염료를 로드 depolarizing 자극 하는 동안 염료와 시 냅 스 준비 목욕 이루어져 있다. 외부 염료 다음 씻 고 SV 주기 이미지 로드 시 냅 스⁷를 칼슘 무료 벨소리 솔루션에 체포 됩니다. 염료 무료 목욕에 자극의 두 번째 라운드 exocytosis, 형광 강도 감소를 측정 하 여 따라 할 수 있는 과정을 통해 FM 석방을 트리거합니다. 풀 vesicles의 수백을 포함 하는 단일 소포에서 SV 인구 양적 모니터링된^6,7일 수 있다. 기능적으로 뚜렷한 SV 풀의 활동-종속 동원 해 부 키스-및-실행 CME 사이클링^8,9대를 비교 하 고 FM 염료 사용 되었습니다. 방법은 별도로 분석 결과 갖는, 자연과 소형 시 냅 스 사이클 활동 (아주 작은 형광 변화를 감지 하 여 photobleaching를 줄이기 위해 매우 중요 한 장비)와¹⁰에 수정 되었습니다. 분석 실험으로 확장할 수 있습니다 ultrastructural 단계로 photoconverting 형광 FM 신호 전송 전자 현미경 검사 법^{11,12,13,14 전자 밀도 라벨으로} .

역사적으로, 칼륨 (“높은 [K⁺]” 라 함)의 높은 농도에 입욕 시 냅 스 준비 되었습니다 depolarizing SV 사이클링;을 유도 하는 자극에 대 한 선택의 방법 개구리 해 NMJ⁵년까지 경작 설치류 두뇌 hippocampal 신경¹⁵, 초파리 glutamatergic NMJ 모델^16,17. 높은 [K⁺] 이렇게 간단, 특수 장비, 필요 고 따라서 대부분의 실험실에 액세스할 수 하지만 응용 프로그램 및 데이터 해석에 대 한 제한이 있습니다. 훨씬 더 순수 적절 한 방법을 사용 하는 신경^4,5,12의 흡입 전극 전기 자극. 이 방법은 활동 전위 전파 연 접 신경의 직접적인 자극에 대 한 터미널, 고 결과 electrophysiological 분석 neurotransmission 함수^{13,14의 직접 비교 될 수 있다 15}, 하지만 특수 장비를 필요로 하 고 기술적으로 훨씬 더 도전적인는. Optogenetics의 출현으로 channelrhodopsin 신경 자극의 사용 이진 Gal4/UAS 시스템²⁰을 사용 하 여 채널 식의 꽉 spatiotemporal 제어를 포함 하 여 추가적인 이점이 있다. 이 방법은 흡입 전극 자극 보다 기술적으로 훨씬 쉽게 하며 매우 저렴 한 LED 광원 보다 아무것도 더. 우리 모두 비교 하 고 대조 초파리 NMJ에서 이러한 세 가지 다른 자극 방법 FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide)의 이미지를 사용 하는 여기,: 간단한 높은 [K⁺ ], 전기 및 새로운 channelrhodopsin 접근을 도전.