صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين
Summary
حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .
Abstract
وتستخدم الأصباغ FM لدراسة دورة حويصلة متشابك (SV). هذه المسابر amphipathic تحتوي على رأسه ماء وذيل مسعور، جعلها للذوبان في الماء مع القدرة بشكل قابل للعكس الدخول والخروج غشاء دهني بليرس. هذه الأصباغ ستيريل نسبيا غير الفلورية في وسط مائي، ولكن أسباب الإدراج في المنشور الخارجي من غشاء البلازما > زيادة 40 س في الأسفار. في نهايات الخلايا العصبية، يتم استيعابه الأصباغ FM خلال SV الالتقام، الذين يتم الاتجار بهم داخل وبين تجمعات SV، وتم إصدارها مع الرقابة SV، توفير أداة قوية لتصور presynaptic مراحل كبيرة. يعتبر نموذج الجينية الأولية وضع المشبك جلوتاماتيرجيك والدالة المورفولوجية الوصلات العصبية العضلية (NMJ)، حيث صبغ FM التصوير قد استخدمت على نطاق واسع لقياس ديناميات SV في طائفة واسعة من الظروف المسخ. المحطة الطرفية متشابك NMJ يتم الوصول إليها بسهولة، مع مجموعة جميلة من boutons متشابك كبيرة مثالية لتطبيقات التصوير. هنا، يمكننا مقارنة وعلى النقيض من ثلاث طرق لتحفيز المورفولوجية NMJ محرك تعتمد على نشاط امتصاص صبغ FM1-43/الإفراج عن: 1) حمام تطبيق عالية [ك+] ديبولاريزي الأنسجة العضلية، 2) شفط العصب المحرك الكهربائي التحفيز ديبولاريزي الأعصاب presynaptic الطرفية، و 3) تستهدف التعبير المحورة وراثيا من المتغيرات تشانيلرهودوبسين للسيطرة المكانية، وحفز الضوء على ديبولاريزيشن. كل من هذه الأساليب على مزايا وعيوب لدراسة تأثيرات الطفرات الوراثية المتعلقة بدوره SV في المورفولوجية NMJ. وسوف نناقش هذه المزايا والعيوب لمساعدة اختيار النهج التحفيز، جنبا إلى جنب مع منهجيات محددة لكل استراتيجية. بالإضافة إلى تصوير فلوري، يمكن أن تكون الأصباغ FM فوتوكونفيرتيد إلى إشارات إلكترون كثيفة تصور استخدام مجهر إلكتروني (TEM) لدراسة آليات دورة SV على مستوى ultrastructural. نحن نقدم المقارنات من [كنفوكل] والمجهر الإلكتروني التصوير من أساليب مختلفة من التحفيز NMJ المورفولوجية ، للمساعدة في توجيه اختيار النماذج التجريبية المقبلة.
Introduction
وقد استخدمت تتميز جميل المورفولوجية اليرقات الوصلات العصبية العضلية (NMJ) جلوتاماتيرجيك المشبك نموذج لدراسة تشكيل المشبك والدالة مع طائفة واسعة من الاضطرابات الوراثية1. المحطة الطرفية العصبون يتكون من فروع إكسون متعددة، كل مع العديد من بتونس متشابك الموسع. هذه varicosities رحيب (تصل إلى 5 ميكرومتر في القطر) تحتوي على جميع الأجهزة كبيرة، بما في ذلك الحويصلات جلوتاماتيرجيك موحدة متشابك (SVs; ~ 40 نانومتر في القطر) في محمية سيتوسوليك وسهولة يمكن نشرة برك2. قفص الاتهام هذه الحويصلات في غشاء البلازما presynaptic الانصهار الموقع النشط المناطق (المزرعة)، حيث يتوسط الرقابة الإفراج العصبي الغلوتامات السكك-الاتصالات متشابك. وفي وقت لاحق، SVs يتم استردادها من غشاء البلازما عن طريق إعادة تدوير قبله، وتشغيل أو كلاثرين بوساطة الالتقام (CME) لدورات متكررة exo/الالتقام. المورفولوجية NMJ يسهل الوصول إليها ومناسبة تماما لعزل ووصف SV دورة طفرات على السواء. استخدام شاشات الجينية إلى الأمام، أدت الطفرات الرواية إلى تحديد الجينات الجديدة الحاسمة ل دورة SV3. وعلاوة على ذلك، أدت عكس النهج الوراثية بدءاً من الجينات معروفة بالفعل لاستيضاح SV دورة آليات جديدة من خلال الوصف الدقيق للمسخ ركوب الدراجات تعمل4. المورفولوجية NMJ مثالي تقريبا كإعداد متشابك تجريبية لتشريح آليات SV الالتقام والرقابة عن طريق أساليب بصريا حويصلة المسار الدراجات خلال كبيرة.
تسمح مجموعة من علامات مضيئة التعقب البصرية من الحويصلات أثناء ركوب الدراجات الديناميات، ولكن أكثر تنوعاً FM صبغ النظير الذي يتم تصنيعه أولاً قبل ماو، واو، وآخرون. 5-هيكلياً، تحتوي على صبغات FM رأسه ماء وذيل محبتين متصلاً من خلال عصابة عطرية، مع منطقة الوسطى منح الخواص الطيفية. ستيريل هذه الأصباغ التقسيم عكسية في الأغشية وليس ‘التقلب المفاجىء’ بين منشورات الغشاء وحتى لا تكون ابدأ حرة في سيتوسول، وهي أكثر بكثير من الفلورسنت في أغشية من المياه5. عكسها الإدراج إلى بلير دهن يؤدي زيادة محاطاً fluorescence6. في نهايات الخلايا العصبية، تتكون كلاسيك FM صبغ تجارب وضع العلامات للاستحمام إعداد متشابك مع الصبغ أثناء ديبولاريزينج التحفيز لتحميل صبغة عن طريق الالتقام SV. صبغ خارجي ثم جرفت ويلقي القبض عليه في دورة SV في حل خالية من الكالسيوم في المسابقة للصورة المحملة نهايات7. جولة ثانية من التحفيز في حمام خالية من صبغة مشغلات إطلاق سراح وزير الخارجية من خلال الرقابة، عملية التي يمكن اتباعها من قبل قياس انخفاض كثافة الأسفار. ويمكن السكان SV من حويصلة واحدة لحمامات السباحة التي تحتوي على مئات حويصلات كمياً رصد6،7. وقد استخدمت الأصباغ FM لتشريح وتعتمد على نشاط تعبئة متميزة وظيفيا SV برك، ومقارنة قبله وتشغيل مقابل CME ركوب8،9. تم تعديل الأسلوب لكل على حدة بالانزيم أثارت، دورة متشابك عفوية ومصغر الأنشطة (مع معدات حساسة للغاية للكشف عن تغييرات صغيرة جداً الأسفار والحد من فوتوبليتشينج)10. فحوصات يمكن تمديدها إلى مستوى ultrastructural قبل فوتوكونفيرتينج إشارة FM الفلورية إلى تسمية وحدة إلكترون كثيفة لانتقال الميكروسكوب الإلكتروني11،،من1213،14 .
تاريخيا، كانت الاستعدادات الاستحمام متشابك في تركيزات عالية من البوتاسيوم (يشار إليه فيما يلي “عالية [ك+]”) الأسلوب المفضل للتحفيز لحمل SV ركوب الدراجات؛ ديبولاريزينج بدءاً من الضفدع اتروبين NMJ5، إلى مثقف القوارض الدماغ الخلايا العصبية هيبوكامبال15، إلى المورفولوجية جلوتاماتيرجيك NMJ النموذجي16،17. هذا النهج [ك+] عالية بسيط، يتطلب أي معدات متخصصة، وهو وبالتالي الوصول إلى معظم المعامل، ولكن قيود لتطبيق وتفسير البيانات. أسلوب أكثر بكثير من الناحية الفسيولوجية مناسبة لاستخدام الشفط الكهربائي التحفيز الكهربائي للعصب4،،من512. هذا النهج محركات نشر إمكانات العمل لحفز مباشرة للعصب بريسينابتيك المحطة الطرفية، ويمكن مقارنة النتائج مباشرة إلى فحوصات الكهربية كبيرة وظيفة13،14، 15، لكن يتطلب معدات متخصصة وتحديا تقنيا أكثر بكثير. ومع ظهور أوبتوجينيتيكس، استخدام تشانيلرهودوبسين الخلايا العصبية التحفيز على مزايا إضافية، بما في ذلك سيطرة الزمانية المكانية للتعبير قناة باستخدام نظام Gal4/UAS ثنائي20. هذا النهج هو من الناحية التقنية أسهل بكثير من التحفيز الكهربائي الشفط ويتطلب شيئا أكثر من مصدر ضوء LED رخيصة جداً. وهنا، نحن نوظف تصوير FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) بيريدينيوم dibromide) لكل مقارنة وهذه ثلاثة أساليب التحفيز المختلفة في المورفولوجية NMJ: عالية بسيطة [ك+ ]، تحدي النهج تشانيلرهودوبسين الكهربائية وجديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عالية التحفيز ديبولاريزينج المالحة [ك+] هو حتى الآن أسهل من الخيارات الثلاثة لصبغ FM تعتمد على نشاط ركوب الدراجات، ولكن يرجح أن الأقل الفسيولوجية29. هذه طريقة بسيطة ديبولاريزيس كل خلية موجوداً في الحيوان الكامل، وحتى لا يسمح للدراسات الموجهة. قد يكون من الممكن تطبيق محليا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء مختبر برودي للمساهمات لهذه المادة. ودعمت هذا العمل MH096832 R01s المعاهد الوطنية للصحة و MH084989 إلى كيلوبايت، والمعاهد الوطنية للصحة بريدوكتورال زمالة F31 MH111144 D.L.K.
Materials
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
Referencias
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
- Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
- Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
- Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
- Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
- Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
- Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
- Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
- Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
- Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
- Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
- Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
- Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
- Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
- Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
- Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
- Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
- Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
- Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
- Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
- Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Lin, J. Y. A user’s guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
- Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
- Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
- Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
- Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
- Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
- Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
- Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
- Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
- Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
- Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).
