הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

כל הניסויים נערכו על פי חקיקה בבריטניה ואישור הוועדה האתית מקומיים. מחקרים שנעשו בבעלי חיים אושרו על-ידי אוניברסיטת בריסטול מחקר בוועדת האתיקה. 1. השתן אלבומין קריאטינין יחס (uACR) הערה: uACR משמש כדי להעריך את החדירות של GFB כדי אלבומין. הנוכחות של אלבומין בשתן מצביעה על חדירות מוגברת מעבר GFB, אשר הוא מנורמל ל קריאטינין לפקד עבור וריאציות של קצב זרימת השתן. Albuminuria הוא סמן נפוצה מחלת כליות כרונית. איסוף שתן על בסיס ניסיוני, במרווחי זמן קבועים (פעם בשבוע עד פעם חודשי) עד הקצה ניסיוני. להגדיר את העכבר כלובים מטבוליים עם דיאטה מים והעשרה. הצב עכברים (זכר, בגילאי 6-8 שבועות) בכלובים בודדים עבור 6-אייץ ‘ בחדר שקט. עכברים החזרה רגיל הדיור, לאסוף שתן מהכלובים ריק. נדרש מינימום של 50 µL.הערה: אם העכבר אינו מייצר שתן בזמן נתון, חזור ביום אחר בחדר חם. Centrifuge בשתן ב 500 x g עבור 10 דקות לאסוף את השתן ולשמר משקעים כדי להעריך את אובדן podocyte. אחסן את השתן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו. לדלל את השתן לתוך 1% אלבומין שור (BSA) ב 1 x Tris buffered תמיסת מלח (TBS pH 7.5) ב שבערך על דילול 1:10000, בהתאם לחומרת albuminuria.הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > µL 400. מיטוב כדי לקבוע דילול נכון כל זמן הצבע. לכמת את ריכוז אלבומין השתן באמצעות של העכבר אלבומין אנזים immunosorbent מקושר assay (אליסה) לפי הוראות היצרן. בקצרה, מעיל לצלחת אליסה, אשר ממוטבת עבור איגוד חלבון, עם 100 µL של נוגדן ראשוני אנטי-העכבר אלבומין (10 µg/mL ב 0.5 M ביקרבונט-קרבונט pH 9.6) לשעה בטמפרטורת החדר. שטיפת עודפי נוגדנים מן הבארות חמש פעמים עם 1 x TBS פלוס 0.05% Tween (pH 8.0), ולהוסיף 200 µL של חסימת פתרון (1 x TBS עם 1% BSA pH 8.0) ללילה בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף µL 100 תקנים (דילול טורי: 2000 µg/mL כדי µg/mL 15.63 ב 1 x TBS עם 1% BSA, pH 8.0), הריק, והדוגמאות מדולל דולר. להשאיר לשעה בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף צלחת חמש פעמים. להוסיף 100 µL של נוגדן זיהוי HRP לכל טוב (10 ng/mL ב 1xTBS עם 1% BSA, pH 8.0), דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח. לשטוף את הצלחת חמש פעמים ולהוסיף 100 µL של אנזים מצע פתרון טוב לכל. להשאיר את הצלחת בחשיכה לפתח למשך 15 דקות, לעצור את התגובה על-ידי הוספת 100 µL של חומצה גופרתית מ’ 0.18 (H2אז4).התראה: H2כדי4 הוא מאכל. לקבוע את ריכוז אלבומין כל מדגם על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 450 ננומטר. השתמש העקומה סטנדרטי כדי לכמת את אלבומין נוכח כל דגימה. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות. לחלופין, להעריך את ריכוז אלבומין השתן באמצעות אלקטרופורזה. להוסיף 5 µL של 4 x חלבון לדוגמה טעינת מאגר µL 15 של שתן. מחממים דגימות עד 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן טעינה לתוך ג’ל טריס precast 4-12%. הפעל את הג’ל 100 וולט, הכתם למשך הלילה בכחול Coomassie לכל הפרוטוקול של היצרן. לאחר הדמיה הג’ל, השתמש densitometry כדי להעריך את הקיפול שינוי ריכוז אלבומין יחסי שליטה.הערה: אם אין להקות שנצפו אלבומין כאשר צפוי, להעריך את ריכוז חלבון בשתן, לכוונן את עוצמת הקול של שתן לג’ל ההתפחה הוספנו. לדלל את דגימת שתן raw ב- dH2O-1:1, 1:5 ו- 1:10.הערה: עוצמת הקול בסוף אמור להיות > 70 µL. מיטוב כדי לקבוע את הדילול נכון של כל דגימה. לכמת את ריכוז קריאטינין השתן שימוש assay כימי לפי ההוראות קיט. בקצרה, טען µL 20 של קריאטינין סטנדרטים, שתן ריק, או מדולל על צלחת טוב 96 דולר. לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה (זהירות, שורף; למנוע מגע עם העור).הערה: ההבדל בין הערכים ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות. ליצור את uACR (µg/מ ג). לנרמל את הנתונים לערך הבסיסית של כל בעכבר על ייצוג גרפי. 2. רקמת ואוסף דם הערה: בכליות ורקמות glomerular יכול לשמש כדי להעריך סמנים ביטוי מבנית, חלבון ו- mRNA של מחלת כליות. הדם יכול לשמש כדי להעריך סמנים של תפקוד הכליות, כגון קריאטינין, אשר יכול להיות מוסדר למעלה, מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli. להכין את הפתרונות הבאים: גלוטראלדהיד 2.5% טרי ב- 0.1 M נתרן cacodylate (pH 7.3), 4% paraformaldehyde 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), תמיסת רינגר יונקים (115 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ סודיום אצטט (CH3COONa), 1.2 מ מ סודיום פוספט (נה2HPO4), 25 מ מ סודיום ביקרבונט (NaHCO3), 1.2 מ מ מגנזיום גופרתי (MgSO4), 1 מ מ סידן כלורי (2CaCl), גלוקוז D (+) בעובי 5.5 מ מ, pH 7.4) עם 1% BSA, 1 x PBS.התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume. 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume להכין את החומרים הבאים: איזופלוריין, חומצה ethylenediaminetetraacetic קטן (EDTA)-מצופה צינורות דם, מחטים 23-25 גרם, 5 מ”ל EDTA מצופה מזרקים, צלוחיות זכוכית 10 מ ל, צלוחיות פלסטיק 10 מ”ל, צינורות פלסטיק 0.5 mL, בתבניות חד פעמיות רקמות, קרח יבש, נוזל N 2, כלי ניתוח העכבר, חיתוך אופטימאליים בינוני (אוקטובר). הנח את העכבר תחת הרדמה עמוקה, אשר מאומתת על ידי העכבר להיות שאינם מגיבים שמוק מחט כדי לרפד את הרגל, באמצעות תא איזופלוריין, או נתיבי המקבילה של הרדמה מסוף כגון בזריקות הרדמה סוכנים (פנטוברביטל, 50 מ”ג/ק”ג בקרום הבטן [IP]; avertin, ה-IP 240 מ”ג/ק”ג), או חשיפה פחמן דו-חמצני (CO2) (75% CO2/25% O2). ללקט העכבר באמצעות ניקוב הלב לתוך החדר השמאלי ולאסוף כמה שיותר דם ככל האפשר. העברת הצינור דם EDTA מצופים עבור עד 4 שעות. אם מועדף, יכול ליקטו עכברים דרך צוואר הרחם פריקה עם מטופל לא להיקרע ומוחלף. שווייץ הכליות דרך הבטן לרחוץ קרח קר 1 x PBS. לבחון glomeruli קורטיקלית, להסיר את מוט אחד של קליפת הכלייה וחותכים לחתיכות3 1 מ מ. כדי לבחון glomeruli עמוק ארתרוזיס-מדולרי, חזור על אותה שיטה עם רקמת לשד. מקום 5 מ של 2.5% פתרון גלוטראלדהיד בקבוקון זכוכית EM. חנות ב 4 º C.התראה: 2.5% גלוטראלדהיד פתרון: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinetהערה: תהליך בתוך חודש לקבלת התוצאות הטובות ביותר. כלים, להסיר בשליש העליון של הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן ארתרוזיס-מדולרי יהיה נוכח, וכן תיקון ב- 5 מ של 4% paraformaldehyde ב 4 ° C עבור ה 24 העברה עד 5 מ”ל של 70% EtOH למשך 24 שעות לפני הטבעה של פרפין.התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume עבור immunofluorescence, מקום שלישי הכליה, כדי להבטיח glomeruli בקליפת המוח והן מדולרי יהיה נוכח, לתוך רקמות עובש ואת המעיל ב אוקטובר במקום על קרח יבש להקפיא ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. עבור חלבון ו- RNA, מקום 3 x 2 מ מ3 חתיכות של קליפת הכלייה לתוך צינורות פלסטיק 0.5 mL, הצמד להקפיא נוזלי N2. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. לאחסון לטווח ארוך רקמות עבור ה-RNA, מקום רקמות 5 כרכים של RNA מייצב פתרון ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. עבור בידוד של glomeruli, לחתוך את רקמת הכליה הנותרת והציבו ב 5 מ של תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA על קרח. היכונו ניפוי glomeruli מיד. 3. קריאטינין פלזמה הערה: קריאטינין פלזמה ניתן להמציא מוסדר מחלת כליות, המעידה על הפחתת הקיבולת סינון של glomeruli. רמות חנקן (BUN) של שתנן בדם יכול גם להיות מוערך, אף הפרוטוקול לא מתואר כאן. Centrifuge את דגימת הדם ב 500 g x למשך 15 דקות ב 4 º C. לאסוף את הפלזמה, אשר יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C לטווח קצר בנקודה זו. לכמת את ריכוז קריאטינין פלזמה שימוש assay קריאטינין כימי לפי ההוראות למעלה עבור קריאטינין השתן בפרוטוקול 1.11. לקבוע את ריכוז קריאטינין כל דגימה על-ידי קריאת את הצלחת ספיגת של 490 nm לפני ואחרי התוספת של הפתרון חומצה.הערה: ההבדל בין ערכים אלה ספיגת הוא ביחס ישר לריכוז קריאטינין בכל מדגם. עיקול רגיל הוא דור של הסטנדרטים. אם חוזר טכני יש קורות חיים ערך גדול מ- 5%, חזור על וזמינותו הדגימות. 4. בידוד של Glomeruli הערה: יכול להיות מבודדים Glomeruli כדי להעריך את החדירות של הפרט glomeruli ex-vivo, וכן את הביטוי של חלבון ספציפי וסמנים mRNA של מחלת glomerular. . קח את רקמת הכליה יכניסו תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA ומנתחים glomeruli באמצעות תקן ניפוי טכניקה13. בקצרה, מחסנית של 70 מיקרומטר (למטה), 100 מיקרומטר, 125 µm, 175 מיקרומטר, מיקרומטר 250 ו מיקרומטר 425 הנפות (העליון) על גביע זכוכית. מועכים את הכליה, באמצעות מזרק בוכנה, לתוך מיקרומטר 425 ניפוי, יקדם באמצעות קרח קר בתרבית של תמיסת רינגר BSA 1%. הסיביות של הכליה יידחפו, להסיר את המסננת העליון, להמשיך לעשות את אותו הדבר הבא. . אני חוזר עד רק ה-100 מיקרומטר הנפות מיקרומטר 70 נותרו. העברת הקציר glomerular נשמר על ידי מיקרומטר 100 על 70 מיקרומטר הנפות עד 10 מ”ל של תמיסת רינגר טריים יונקים עם BSA 1%, על קרח.הערה: אם מספר glomeruli לכל תמיסת רינגר mL כמה, להפחית את עוצמת הקול של תמיסת רינגר נהגו לאסוף glomeruli שתי הנפות. הסר מ של התמיסה המכילה glomeruli לתוך שני צינורות נפרדת (2.5 מ ל כל אחד), צנטריפוגה-1000 g x 10 דקות ב 4 º C. להסיר את תגובת שיקוע, הצמד להקפיא glomeruli נוזלי N2 לפני אחסון ב- 80 ° C עבור חלבון והפקת RNA במועד מאוחר יותר. מקם את הפתרון הנותרים המכילים glomeruli באמבט מים בטמפרטורה 37 ° C למדידת glomerular LpA / Vאניex-vivo. להשלים בתוך 3 שעות של הסרת הכליה. 5. חדירות מים glomerular (LpA / Vאני) הערה: glomerular LpA / Vאני assay מאפשר שמחוץ במדידת החדירות של הפרט glomeruli ב לשחזור באופן מהיר. עלייה glomerular LpA / Vאני מציין שיבוש GFB, אשר הוא סוגסטיבי של מחלת כליות. להגדיר את glomerular LpA / Vאני לבוש כפי שמתואר סלמון ואח’10. נא עיין באיור 1 עבור תרשים מפורט הגדרת. להכין את הפתרונות הבאים: תמיסת רינגר יונקים עם 1% BSA (pH 7.4), תמיסת רינגר יונקים עם 8% BSA (pH 7.4). לחמם את שניהם ל- 37 מעלות צלזיוס. משוך micropipettes מ זכוכית צינורות קפילר (צפיפות אופטית: 1.2 מ מ). ליצור 5-8 מיקרומטר צמצם עצה על ידי גזירה את micropipette תחת מיקרוסקופ. להשתמש את glomerular LpA / Vאני לבוש לתפוס glomeruli בודדים ללא פגע חופשיים של קפסולה של באומן ושברי הכרישים על גבי micropipette באמצעות שאיבה. סיכום מפורט של וזמינותו oncometric מצוי סלמון ואח’10. בקצרה, ברגע פקעית הוא נתפס ומאובטחים על micropipette היניקה, להתחיל בהקלטת וידאו פקעית מתחת למיקרוסקופ. ראשית, equilibrate של פקעית בפתרון 1% BSA רינגר ב-30 s לפני המעבר של perifusate מרוכזת 8% BSA תמיסת רינגר 10 s. לאחר מכן לעבור את perifusate חזרה אל תמיסת רינגר BSA 1%, לעצור את ההקלטה. לשטוף את פקעית, חזור על התהליך עבור 10-15 glomeruli לכל העכבר. להבטיח תעריפי זרימת perifusate הם זהים ולא על מהירות (10 מ ל/דקה) כדי לא לעוות את מבנה glomerular. למדוד את קצב הראשונית של הצטמקות glomerular כדי לחשב את החדירות glomerular מים (L.p. A) מנורמל לאמצעי האחסון glomerular (Vאני). ניתן למצוא מידע מפורט לגבי הניתוח סלמון ואח’10. 6. המחזורית חומצה שיף (PAS) כתם הערה: הכתם PAS ידגיש הממברנות במרתף של לולאות נימי glomerular, האפיתל צינורי. הוא מאפשר ויזואליזציה מפורטת של תאים glomerular, mesangial מטריקס ופוטנציאל הרחבה, שינויי פוטנציאל GBM (קרי, עיבוי ואי סדרים). בסעיף קליפת הכליה פרפין-מוטבע, כדורגלן-קבוע באמצעות מיקרוטום עובי 5 מיקרומטר על גבי שקופיות מצופה פולי-L-ליזין. יבש ב 37 ° C עבור ה 1 ודא המקטע אינו מכיל כל הקפלים או חורים, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה מתחת למיקרוסקופ. Deparaffinize השקופיות על-ידי המקננת פעמיים ב קסילן (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) למשך 3 דקות, פעמיים ב 100% EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב 95%, 70% ו- 50% EtOH למשך 3 דקות כל אחד, כל בטמפרטורת החדר. מימה מחדש את השקופיות dH2O. דגירה השקופיות בפתרון המחזורית חומצה (זהירות, מגרה; שימוש בארון fume) (1 g/dL) עבור 5 דקות ולאחר מכן לשטוף השקופיות מספר שינויים של dH2O. להשתמש מיכל עם 100 מ ל dH2O בטמפרטורת החדר.התראה: חומצה המחזורית פתרון: מגרה; להשתמש בארון fume דגירה בשקופיות ריאגנט של שיף (Parasoaniline HCl 6 g/L ו נתרן metabisulfite 4% HCl 0.25 מול/ליטר) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז מים במשך 5 דקות. Counterstain עם Hematoxylin 3 s לפני השטיפה ביסודיות שקופיות פועל מי ברז למשך 15 דקות.הערה: אופטימיזציה מסוימים עשויים להידרש כדי לקבוע את הזמן האופטימלי עבור Hematoxylin מכתים. מייבשים השקופיות באמצעות ההפך של פרוטוקול deparaffinization בשלב 6.2. לסיים עם קסילן. אוויר יבש שקופיות והר עם מדיה מבוססי קסילן הרכבה. תמונה על מיקרוסקופ אור בהגדלה X 400 להעריך glomerular מבנים. להעריך את הדברים הבאים: עיבוי ואי סדרים של GBM, כיווץ של לולאות נימי, שהותירה רקמות, טרשת נפוצה, התפשטות הסלולר (אנדותל, podocyte, mesangial, או תאים דלקתיות שחדר את אניץ).הערה: עבור הערכה מקיפה של פתופסיולוגיה glomerular, נגעים בחלקים אחרים של הכליה צריך להיות הערכה, כגון בקוריאנית. 7. הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הערה: TEM מאפשר הבחינה של מומים מבניים אולטרה בכליה, כגון GBM, תהליכים רגל podocyte, ו fenestrations אנדותל, אשר אינם גלויים עם מיקרוסקופ אור. זה חשוב דגמים היכן כליות נזק לא כל-כך מבטאים את זה (כלומר, לא albuminuria, מומים מבניים עיקריים). לקחת gluteraldehdye 2.5% – קבוע קוביות הכליה ותקן פוסט ב 1% אוסמיום ארבע-חמצני עבור 1 ח’ שטיפת ב 50 מ ל 0.1 M cacodylate מאגר (pH 7.3) ולאחר מכן 50 מ של dH2O (3 x 15 דקות משתנה).התראה: 2.5% גלוטראלדהיד: רעיל, sensitizer, מגרה; השתמש ב- fume cabinet. 0.1 cacodylate נתרן M: רעיל, שימוש בארון fume מייבשים עם EtOH, להטביע שרף Araldite. לחתוך קטעים ב- 50-100 ננומטר עובי ו כתם עם 3% uranyl (מימית) אצטט והפתרון ציטראט של ריינולדס עופרת. קח את micrographs דיגיטלי על מספר אזורים פקעית-940 X, 1250 X, ו- 6200 X כדי לוודא podocytes, GEnCs, GBM ו מזנגיום ניתן לזהות. השתמש ImageJ כדי לנתח glomeruli עיוור. הגדר את המידה עבור כל micrograph 6200 X על ידי ציור קו בין שתי נקודות מרחק ידוע, כגון סרגל. ללכת לניתוח, ולאחר מכן הגדר קנה מידה, שבו מוצגות את אורך הקו בפיקסלים. הקלד המרחק ידוע ויחידות מידה. השתמש הפרוטוקולים המפורטים להלן עבור המידה של כל פרמטר.הערה: ניתוח זה דורש בסביבות 1 יום לפי העכבר. לשימוש הולם עוצמה סטטיסטית, המדידות הממוצע מ glomeruli 3 מ- 3 עכברים. GBM, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X, למדוד את עובי GBM בנקודה שבה קווי הרשת לחצות GBM. מדוד קרום התא אנדותל הבזליים אל קרום התא תהליך של הרגל podocyte הבזליים בהשקה בניצב על קרום התא אנדותל באמצעות הכלי קו ישר. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות. עבור המספר אשנוב אנדותל, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר fenestrations אנדותל עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית. עבור podocyte הרגל תהליך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של התהליכים רגל podocyte לחצות את קווי הרשת. למדוד את הרוחב בחלק הרחב ביותר של תהליך רגל בו הוא נפגש עם GBM; ודא הקו בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות. Podocyte חתך רוחב, להוסיף רשת דיגיטלית קבועה (10 x 10) מעל micrograph 6200 X. למדוד את הרוחב של דיאפרגמות לחתוך podocyte לחצות את קווי הרשת. זוהי נקודת איפה התהליכים רגל הם הקרובים ביותר יחד, בחלק הרחב ביותר של כל תהליך רגל, מן podocyte ממברנה אל הממברנה. ודא המדידה בניצב הטנגנס של קרום הבסיס podocyte. לקבוע את המידה כלומר עבור כל פקעית מ 10 מדידות. עבור המספר של podocyte רגל תהליכים, למדוד את האורך של GBM נוכח micrograph 6200 X, לספור את מספר התהליכים רגל podocyte עבור אורך יחידה של GBM. קח ממוצע בין micrographs לפחות 4 לכל פקעית. עבור כיסוי שטח sub-podocyte, ראה שיטה מפורטת של ניל ואח. 14. שימוש של micrographs X 940, לבחון glomeruli לנוכחות של מבנה לא תקין, פיקדונות, תסנין לפי העין. 8. immunofluorescence עבור Podocyte וסמנים אנדותל הערה: Immunostaining מאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של חלבונים, כגון לולאות אנדותל נימי, אשר ניתן לכווץ את מחלת glomerular. מקם את OCT-עובש המכיל הכליות קפואים ב-20 ° C כבר שעתיים לפני חלוקתה. ודא שהשטח לחתוך של הכליה ממוקמת בקפידה נגד לתחתית התבנית-OCT כדי לאפשר מקטעי רקמת orientated טוב. שימוש של cryostat, ברקמות סעיף 5 מיקרומטר עובי על פולי-L-ליזין מצופה שקופיות.הערה: ודא ואין קיפולים או חורים בסעיף רקמות, אשר יכולה לעוות המורפולוגיה. בעת הסרת מ cryostat, לתקן את שקופיות ב- 4% מחברים עבור 10 דקות לשטוף שקופיות 3 x 5 דקות במיכל עם 100 מ של dH2O.התראה: 4% מחברים: מקבע, שימוש בארון fume כדי למזער את כמות נוגדנים בשימוש, לצייר מקטעים עם עט הידרופובי. אל תתנו הסעיפים יבש. דגירה בחסימה פתרון (BSA 3% ו- 5% סרום רגילה ב- 1 x PBS) לשעה בטמפרטורת החדר. הסר את הפתרון חסימה עם העצמות, דגירה מקטעים עם נוגדן ראשוני (Nephrin, podocin או PECAM-1) מדולל 1:250 (BSA 3% ב- PBS 1 x). המקום שקופיות בתוך תא humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. אם תא לח אינה זמינה, קלות להניח פס קטן של מצלמות-מיקרוסקופים מעל לשקופית מצופים נוגדן. יש להיזהר בעת הסרת למחרת כדי לא לשבש את המקטע. רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS. דגירה עם 1:1000 דילול המתאים נוגדנים משניים פלורסנט (BSA 3% ב- 1 x PBS) עבור 2 h בטמפרטורת החדר בחושך. רחץ שקופיות 3 x 5 דקות ב- 1 x PBS. הר עם פלורסנט טעינת המדיה המכילה דאפי. תמונות שקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה X 400 כדי להציג glomeruli. ודא שזה היא מתעוורת כדי למנוע הטיה. השתמש ImageJ כדי לנתח את העוצמה מכתימים מנורמל לאזור glomerular, ואת התבנית של צביעת, קרי, מספר לולאות נימי מנורמל לאזור glomerular, באופן עיוור. 9. חלבון החילוץ החיוורים ומכתים המערבי הערה: סופג המערבי מאפשר לנו להעריך את החלבונים ביטוי ידוע dysregulated של מחלת כליות. לדוגמה, ירידה בביטוי podocin ו- nephrin מצביע על אובדן podocyte. תמצית חלבון לבין קליפת הכלייה sieved glomeruli; הפרוטוקול זהה עבור כל אחד, הנפח של פירוק מאגר מותאם עבור כמות הרקמה. הפשרה כליות/glomeruli על הקרח לפני הוספת NP-40 פירוק מאגר מעכבי פרוטאז, פוספטאז המכיל (150 מ מ NaCl, 1% NP-40, 50 מ מ טריס pH 8). Homogenize לדוגמה עבור 30 s. דגירה בדגימות homogenized על קרח למשך 30 דקות, vortexing במרווחי זמן קבועים. Centrifuge את הדגימות ב g x 10,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע לרכבת התחתית טריים על קרח.הערה: מצפה לשחזר כ- 1 מ ג חלבון ליום המדגם. Denature את החלבונים באמצעות המאגר x Laemmli תקן 4. מרתיחים את התערובת ב 95-100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. להעריך את הביטוי של חלבונים סמן תא glomerular (Nephrin, Podocin, PECAM-1, וכו ‘.), זרחון וביטוי חלבונים ידוע/המשוערות כדי להשתנות ב glomeruli/הכליה של הדגם המחלה באמצעות ווסטרן סופג ( השיטה הרגילה; ורד פנחסוב ויאנג15).הערה: הפרוטוקול משתנה בהתאם גודל ואת שפע של החלבון עניין. 10. RNA החילוץ ואת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) הערה: mRNA ביטוי ניתוח מאפשרת לנו לקבוע איך הגנים מוסדרים, מחלת כליות, כגון שינויים ביטוי גנים שחבור חליפי. בעוד קליפת הכלייה עדיין קפוא, ביסודיות לטחון ב- 3 מ”ל של פנול ריאגנט באמצעות שהעקב פצצות מרגמה. אם באמצעות תמציות glomerular, להוסיף 1 מ”ל של ריאגנט פנול, homogenize לדוגמה עבור 30 s.התראה: ריאגנט TRIzol: מגרה; להשתמש בארון fume לבצע משימת חילוץ RNA באמצעות השיטה המתוארת על-ידי Chomczynski ועוד Sacchi16.הערה: ערכות חילוץ RNA מסחריים זמינים כחלופה לשיטה זו. להעריך את כמות ואיכות RNA שהושג באמצעות אחת השיטות השונות הזמינות. רנ א היא aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס בנקודה זו. להימנע חוזר להקפיא מפשיר.הערה: אם חדש לשיטה זו, בדוק את האיכות של RNA לפני שתמשיך לשלב הבא על-ידי הפעלת את הרנ א ב ג’ל agarose כדי להבטיח 28S ברור והלהקה ribosomal 18S. מצפה להתאושש בין 2-5 µg של RNA בשיטה זו. DNase לטפל µg 1 של RNA (יצירת אמצעי אחסון עד 10 µL במים נטולי RNase בתוספת 1 µL של DNase µL 1 DNase המאגר) עבור 1 h-37 מעלות צלזיוס. לעצור את התגובה עם 1 µL של DNase להפסיק פתרון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הוסף µL 0.5 oligo (dT), תחל אקראי. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מיד להרוות בקרח במשך 5 דקות. להוסיף את הפעולות הבאות; האנזים רוורס טרנסקריפטאז MMLV (400 U; החלף DEPC H2O RT – שליטה לדוגמה), מאגר MMLV (1 x), מעכב מיקס (0.5 מ מ), ואת ribonuclease dNTP (40 U); להפוך µL עד 50 עם מים DEPC. דגירה תערובת התגובה ב 37 ° C עבור h 1 ואחריו 95 ° C עבור 5 דקות כדי לבטל את האנזים.הערה: כדי להפיק תשואה גבוהה יותר של cDNA, דגירה ב 37 ° C עבור עד 3 שעות. להעריך את כמות ואיכות cDNA באמצעות השיטות השונות הזמינות. שימוש PCR כדי להעריך את דפוסי שחבור וביטוי של mRNA של גנים היא שממוצע dysregulated במודל glomerular המחלה. הפרוטוקול משתנה בהתאם הגן עניין.