その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出
Summary
ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization を視覚化する方法を示します。
Abstract
規制の蛋白質蛋白質の相互作用は多くのシグナル伝達イベントの基本理念と、このようなイベントの検出はそのような経路の編成方法と動作を理解する上で重要な要素。細胞のタンパク質-タンパク質相互作用を検出する多くの方法がありますが、比較的少数は内因性のタンパク質間相互作用を検出する使用できます。そのようなメソッドは、近接結紮アッセイ (PLA) には、その使用をお勧めするいくつか利点があります。タンパク質-タンパク質相互作用解析の他の一般的な方法と比較して、PLA は、比較的高い感度と特異性、最小限の細胞操作と、本明細書に記載されているプロトコルに実行できます、ターゲット固有の唯一の 2 つが必要です。種に由来する抗体 (e.g, マウスおよびウサギから) と 1 つの特殊な試薬: 共有リンク特定のオリゴヌクレオチドは、二次抗体のセット、互いの近くになったときに作成、。in situ PCR やローリング サークル増幅の増幅プラットフォーム。このプレゼンテーションでは、固定細胞における MST1 と MST2 近接の変化を視覚化する PLA 手法を適用する方法を示します。本稿で説明する手法は、細胞のシグナル伝達研究の分析に特に当てはまります。
Introduction
MST1/カバ シグナリングパスの中断は、発達障害や発癌1に接続されています。哺乳類で MST2 と MST1 キナーゼをアクティブ化 (リン酸化) MOB1 と LATS1/2、後者の場合、廃止し、転写コアクチベーターはい関連タンパク質 (ヤップ)2を不活性化します。アクティブ (ペプタイド) 形式でヤップは発癌性活動は、細胞増殖の遺伝子のトランスクリプションを高める逆に、ヤップはカバ経路による不活化、細胞増殖の抑制し、アポトーシス促進3。体内では、MST1 と MST2 アクティブな homodimers として主に存在しますが、発癌刺激 MST1/MST2 ヘテロのレベルを増やすことができます、このようなヘテロ非アクティブ4。ただし、MST1/MST2 heterodimerization の規制方法の不十分な理解ままです。両方ホモ ・ ヘテロが仲介経由MST1 の C ターミナル コイルド コイル領域と相互 MST2 サラ ドメイン5として知られています。を使用して、その場でPLA は人間シュワン細胞 (HSC) と人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK 293) に MST1/MST2 ヘテロの存在を示すこの資料で説明します。PLA は、他のタンパク質・ タンパク質相互作用検出方法上の利点を識別して定量化導入遺伝子発現の必要性または epitope の札の使用なしで内因性のタンパク質の相互作用を検出できるので6。
シグナル伝達経路はタンパク質の条件付きの協会によって主制御されます。たとえば、ほとんど受容体チロシンキナーゼの刺激は、ホモまたはヘテロ二量化し追加の細胞内シグナル伝達タンパク質は、自身と後続の協会、さらに錯形成をつながる.PLA 法の目的は、蛋白質がより小さい 30-40 nm 離れて細胞、タンパク質間の距離を可視化することです。タンパク質近接は通常種で発生した適切な一次抗体と細胞を培養して、検出 (e.g、ウサギおよびマウス) 各相互作用の蛋白質に対する種特異的な二次抗体を追加する。短い事前結合 DNA プローブします。DNA プローブは近接、特定リンク DNA のオリゴヌクレオチドの in situ PCR またはローリング サークル メカニズムによって増幅するためのプラットフォームを形成、これらのプローブの両方を同時にバインドできます。増幅反応に追加された蛍光タグにより容易に定量化およびセル7,8,内の特定の領域にローカライズできる蛍光ドットとして表示される相互作用の蛋白質の可視化9,10。
Protocol
Representative Results
Discussion
(14-16) 培養細胞での実験を実行する非常に便利だし、サンプルの顕微鏡分析中にすべての時間を変更する必要はありません、この実験用チャンバー スライド ガラスを使用すると便利だとわかった。抗体との交差汚染のリスクの増大など、いくつかの合併症が発生します。したがって、各ウェルを洗浄することをお勧め、実験の期間の増加にもかかわらずの Coplin jar を使用する代わりに個別に…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
最適化と特定のマリア ラドゥとガリーナ Semenova で、このプロトコルの検証に貢献する検査室全体のチャーノフに感謝いたします。また、フォックスチェイスがんセンターの細胞イメージング施設のアンドレイ エフィーモフを感謝いたします。この作品は、JC に NIH (R01 CA148805) からの助成金によって支えられました。
Materials
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Contains 1x Blocking solution, 1x antibody Diluent |
| Wash Buffers, Flurescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B |
| Mounting Medium with DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detection Reagents Red | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Contains 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlification Red, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antibody |
| MST2 antibody | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antibody |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in PBS for fixing solution |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | To prepare 0.1% Triton x-100 in 1xPBS for Permeabilization solution |
| Confocal microscopy | Leica TCS SP8, 63x | Image analysis with ImageJ software |
Referencias
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