Høst Venom toksiner fra Assassin Bugs og andre Heteropteran insekter
Summary
Selv om mange insekter i underordenen tæger (Insecta: Hemiptera) er giftige, deres venom sammensætning og funktioner af deres venom toksiner er for det meste ukendte. Denne protokol beskriver metoder til at høste heteropteran venoms for yderligere karakterisering, ved hjælp af elektrostimulation, chikane og kirtel dissektion.
Abstract
Heteropteran insekter som assassin bugs (Reduviidae) og gigantiske vand bugs (Belostomatidae) nedstammer fra en fælles predaceous og giftige forfader, og størstedelen af bevarede heteropterans bevarer denne trofiske strategi. Nogle heteropterans har skiftet til fodring på hvirveldyr blod (såsom kysse bugs, Triatominae; og væggelus, Cimicidae) mens andre have vendt tilbage til fodring på planter (de fleste Pentatomomorpha). Dog er med undtagelse af spyt bruges af kysse bugs til at lette blod-fodring, lidt kendt om heteropteran venoms sammenlignet med venoms edderkopper, skorpioner og slanger.
En hindring for karakterisering af heteropteran venom toksiner er struktur og funktion af venom/labial kirtler, som er både morfologisk komplekse og udføre flere biologiske roller (forsvar, bytte opsamling og ekstra mundtlig fordøjelsen). I denne artikel vil beskrive vi tre metoder vi har med succes brugt til at indsamle heteropteran venoms. Først, vi præsenterer elektrostimulation som en praktisk måde at indsamle venom, der er ofte dødelig, når injiceres bytte dyr, og som overflødiggør kontaminering af kirtelvæv. For det andet viser vi, at blide chikane af dyr er tilstrækkeligt til at producere venom ekstrudering fra Snabel og/eller venom spytte i nogle grupper af heteropterans. For det tredje, vi beskriver metoder til at høste venom toksiner ved dissektion af bedøvet dyr at få gift kirtler. Denne metode er et supplement til andre metoder, som det kan tillade høstning af toksiner fra taxa hvor elektrostimulation og chikane er ineffektive. Disse protokoller vil sætte forskerne til at høste toksiner fra heteropteran insekter til struktur-funktion karakterisering og mulige anvendelser inden for medicin og landbrug.
Introduction
Heteropteran venoms er potent bioaktive stoffer1. For eksempel, letter venom/spyt sekreter af blod-fodring tæger som kysse bugs (Triatominae) og væggelus (Cimicidae), fodring af forstyrre hæmostase2. Toksiner i disse venoms målrette flere veje herunder koagulation, trombocytaggregation og vasokonstriktion, samt smerter og kløe veje. Venoms fra de fleste andre heteropteran arter er tilpasset til at lette prædation snarere end blod-fodring. Deres venoms forårsage lammelse, død og væv flydendegørelse når injiceres hvirvelløse dyr3,4. Når injiceres i hvirveldyr, kan deres gift også har drastiske virkninger. For eksempel, forårsager injektion af venom fra assassin bug Holotrichius indre i hvirveldyr smerte, muskellammelse og blødning; mus røgter ved denne bug dør hurtigt på grund af respiratorisk lammelse5.
Transkriptom og proteom undersøgelser har afsløret nogle heteropteran venoms protein sammensætning. Venoms predaceous arter er rig på proteaser, andre enzymer, og peptider og proteiner af ukendt struktur og funktion6,7,8. Tægen venom er rig på triabin protein familie, hvis medlemmer dybt påvirker koagulation, trombocytaggregation og vasokonstriktion2,9. Det vides dog ikke, hvilke toksiner ligge til grund for de fleste bioactivities af venom. For eksempel, venom af tægen Triatoma infestans er blevet rapporteret at være smertestillende og hæmmer natrium kanaler10, men de ansvarlige komponenter mangler at blive belyst. Ligeledes, det er ikke kendt hvad komponent(er) af assassin bug venom forårsage lammelse eller smerte. En forudsætning for at identificere de ansvarlige for særlige venom bioactivities samt kendetegner struktur og funktion af roman venom toksiner, giftstoffer er at få gift.
Venom er opnået fra heteropterans af elektrostimulation5,6,7,8,11,12,13, provokation af defensiv svar4,8, mekanisk klemme i thorax12,14,15,16, dissekere ud gift kirtler8,17 ,18,19,20,21,22, og anvendelsen af agonister muskarine acetylcholin receptor23. At dømme de potentielle fordele og ulemper ved enhver metode, der er kompliceret af morfologi af heteropteran gift kirtler, som består af en vigtigste kirtel med to separate lumen, forreste vigtigste kirtel (AMG) og posterior vigtigste kirtel (PMG), samt en tilhørende tilbehør kirtel (AG). Disse forskellige kirtel rum producere forskellige protein sekreter, som kan være specialiserede for forskellige biologiske funktioner herunder bytte capture, forsvar og ekstra mundtlig fordøjelsen8,17. I peiratine og ectrichodiine assassin bugs, har AMG været forbundet med bytte opsamling og PMG med ekstra mundtlig fordøjelsen17. Men i harpactorine bug Pristhesancus plagipennis PMG er specialiseret til bytte opsamling og fordøjelsen mens AMG er hypotese for at udskille defensive venom8. AG er blevet beskrevet som havende lille sekretoriske funktion i assassin bugs8 eller som en større site af protease opbevaring i gigantiske vand bugs23. Klart, yderligere arbejde er nødvendigt at klarlægge funktionen af hver kirtel rum blandt forskellige heteropteran undergrupper og bestemme funktionen af de fleste venom toksiner. I denne rapport beskriver vi protokoller for høst venom toksiner fra heteropterans mod dette mål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest afgørende skridt i høst assassin bug venom er at vælge den passende metode afhængig af i forbindelse med undersøgelsen. Hver af de tre metoder præsenteres for høst heteropteran venoms har fordele og ulemper afhængigt af downstream applikationer.
Inducerende bugs at udvise venom fra Snabel (protokoller 1-3) undgår forurening af venom ved glandulær væv. Derudover disse metoder er ikke-dødelige og kan gentages mange gange i løbet af en bug’s liv. Elektrostimulation normalt g…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender finansiel støtte fra det australske Forskningsråd (tilskud DP130103813 og LP140100832 til G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 til EABU), den australske National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 til G.F.K.), og University of Queensland (postdoc stipendium til A.A.W.).
Materials
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
Referencias
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A., Kaiser, E. . Animal and Plant Toxins. , 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Maran, S. P. M., Ambrose, D. P., Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. . Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P., Ambrose, D. P. . Insect Pest Management, A Current Scenario. , 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the ‘spitting’ behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
