Supressão de sinalização pró-fibróticos potencializa mediada por fator de reprogramação de fibroblastos embrionários de rato em Cardiomyocytes induzida
Summary
Aqui nós apresentamos um método robusto para reprogramar fibroblastos embrionários primários em cardiomyocytes funcional através de superexpressão de GATA4 Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) juntamente com a inibição da sinalização do TGF-β. Nosso protocolo gera cardiomyocytes bater tão cedo quanto pós-transdução de 7 dias com até 60% eficiência.
Abstract
Trans-diferenciação do tipo de uma célula somática em outro tem um enorme potencial para modelar e tratar doenças humanas. Estudos anteriores mostraram esse rato embrionárias, fibroblastos dérmicos e cardíacos podem ser reprogramados em células-induzida-casos-como funcionais (iCMs) pela superexpressão de fatores de transcrição cardiogênico incluindo GATA4, Hand2, Mef2c, e Tbx5 tanto in vitro e in vivo. No entanto, esses estudos anteriores têm mostrado eficiência relativamente baixa. A fim de restaurar a função cardíaca após lesão, os mecanismos que regem a reprogramação cardíaca devem ser elucidados para aumentar a eficiência e a maturação de iCMs.
Demonstramos anteriormente que a inibição da sinalização pró-fibróticos dramaticamente aumenta a eficiência de reprogramação. Aqui, detalhamos os métodos para alcançar uma eficiência de reprogramação de até 60%. Além disso, descrevemos vários métodos, incluindo citometria de fluxo, imunofluorescência imagem e imagem latente de cálcio para quantificar a reprogramação eficiência e maturação dos fibroblastos reprogramadas. Usando o protocolo detalhado aqui, podem ser realizados estudos mecanicistas para determinar os reguladores positivos e negativos de reprogramação cardíaca. Estes estudos podem identificar caminhos de sinalização que podem ser direcionados para promover a reprogramação eficiência e maturação, o que poderia levar a terapias celulares novela para tratar a doença de coração humana.
Introduction
Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte no Estados Unidos1. Aproximadamente 800.000 americanos experimentam um primeiro ou recorrente do miocárdio (MI) por ano1. MI, na sequência da morte de cardiomyocytes (CMs) e Fibrose cardíaca, depositados por fibroblastos cardíacos registrados, afectar o coração função2,3. Progressão da insuficiência cardíaca após MI é em grande parte irreversível devido a pobre capacidade regenerativa do adulto CMs4,5. Enquanto atuais terapias clínicas retardar a progressão da doença e diminuem o risco de futuros eventos cardíacos6,7,8,9, sem terapias reverter a progressão da doença, devido à incapacidade de regenere o CMs pós-infarto10. Terapias celulares romance surgem para tratar pacientes seguindo mi decepcionante, ensaios clínicos, entregando as células-tronco para o coração após MI até agora mostraram-se inconclusivos regenerativo potencial11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas humanos-derivado (hiPSCs) de fibroblastos pela superexpressão de quatro fatores de transcrição, primeiramente demonstrado por Takahashi & Yamanaka, abriu as portas para novos avanços na terapia de célula19. Estas células podem se diferenciar em todas as três camadas germinativas19, e vários métodos altamente eficientes para gerar um grande número de CMs têm demonstrados anteriormente20,21. HiPSC-derivado CMs (quadris-CMs) oferece uma plataforma poderosa para estudar cardiomyogenesis e pode ter implicações importantes para reparar o coração após lesão. No entanto, quadris-CMs atualmente enfrentam obstáculos translacionais devido a preocupações de teratoma formação22, e sua natureza imatura pode ser pro-arrhythmogenic23. Reprogramação de fibroblastos em hiPSCs despertou interesse em diretamente reprogramação de fibroblastos em outros tipos de células. Ieda et al demonstraram que superexpressão de GATA4, Mef2c e Tbx5 (GMT) em resultados de fibroblastos em reprogramação direta linhagem cardíaca, embora a baixa eficiência24. Reprogramação de eficiência foi melhorado com a adição de Hand2 (GHMT)25. Desde os primeiros estudos, muitas publicações têm demonstrado que, alterar o coquetel fator reprogramação com transcrição adicional fatores28,de27,26,29, cromatina modificadores30,31, microRNAs32,33ou34 leva à melhoria de moléculas pequenas reprogramação eficiência e/ou maturação das células de casos-como induzidas (iCMs ).
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar iCMs de fibroblastos embrionários de rato (MEFs) com alta eficiência. Anteriormente mostramos que o GHMT cocktail é significativamente melhorado com a adição de miR-1 e miR-133 (GHMT2m) e é melhorada quando pró-fibróticos inclusive transformar o fator de crescimento β (TGF-β) sinalização de vias de sinalização ou associadas a Rho vias de sinalização da proteína quinase (ROCK) são inibidas35. Usando este protocolo, mostramos que aproximadamente 60% das células express T de troponina cardíaca (miocardite), aproximadamente 50% express α-actinin, e um elevado número de células de batida pode ser observado logo em dia 11 transdução de reprogramação de fatores e o tratamento a seguir com o TGF-β tipo I inibidor do receptor A-83-01. Além disso, esses iCMs expressam proteínas de junção gap incluindo connexin 43 e apresentam contração espontânea e transientes de cálcio. Esta marcada melhoria na eficiência em comparação com estudos anteriores de reprogramação demonstra o potencial para regenerar CMs de populações de células endógeno que permanecem no infarto de pós coração.
Protocol
Representative Results
Discussion
O presente estudo descreve uma estratégia de alta eficiência para reprogramar diretamente fibroblastos em iCMs funcional através de entrega de GHMT2m fatores combinados com a supressão das vias de sinalização pró-fibróticos de reprogramação. Utilizando citometria de fluxo, imagem latente de imunofluorescência, cálcio imaging e bater a contagem de células, vamos mostrar a maioria das células no presente protocolo submetido a reprogramação bem sucedida e adotar o destino de linhagem CM. Mostramos anteriorme…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por fundos da Fundação Boettcher Webb-Waring biomédica pesquisa programa, americano coração Associação cientista desenvolvimento Grant (13SDG17400031), Universidade do Colorado departamento medicina pendentes do início de carreira Programa acadêmico, Universidade de Colorado divisão de Cardiologia Barlow Nyle doação e NIH R01HL133230 (para Klein). A.S.R foi apoiada pelo NIH/NCATS Colorado CTSA Grant número TL1TR001081 e uma bolsa doutorandos do consórcio Universidade do Colorado para pesquisa de fibrose & tradução (CFReT). Esta pesquisa foi apoiada também pela concessão de apoio do centro de câncer (P30CA046934), a concessão de núcleos de investigação de doenças pele (P30AR057212) e o núcleo de citometria de fluxo no Campus Anschutz-médica da Universidade do Colorado.
Materials
| C57BL/6 Mice | Charles River's Laboratory | 027 | For MEF isolation |
| Platinum E (PE) Cells | Cell Biolabs, INC | RV-101 | For retrovirus production |
| DMEM High Glucose | Gibco | SH30022.FS | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Medium 199 | Life Technologies | 11150-059 | Component of iCM media |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100106 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Donor Horse Serum | Gemini | 100508 500 | Component of iCM media |
| MEM Essential Amino Acids, 50X | Life Technologies | 11130051 | Component of iCM media |
| Sodium Pyruvate Solution, 100X | Life Technologies | 11360070 | Component of iCM media and for calcium imaging |
| MEM Non-Essential Amino Acids, 100X | Life Technologies | 11140050 | Component of iCM media |
| MEM Vitamin Solution, 100X | Life Technologies | 11120-052 | Component of iCM media |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 41400045 | Component of iCM media |
| B27 | Gibco | 17504-044 | Component of iCM media |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| GlutaMAX (L-Glutamine Supplement) | Gibco | 35050-061 | Component of iCM, PE, and Growth media |
| Blasticidin-HCl | Life Technologies | A11139-03 | Component of PE media |
| Puromycin dihydrochloride | Life Technologies | A11138-03 | Component of PE media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | For detaching cells from culture dishes |
| A-83-01 | R&D Systems – Tocris | 2939/10 | Treat cells to inhibit TGF-β signaling – promotes high efficiecy reprogramming. Use at 0.5 µM |
| DMSO | Thermo Scientific | 85190 | For dilution and storage of A-83-01 and component of Freeze Medium |
| SureCoat | Cellutron | SC-9035 | For coating dishes to plate MEFs |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2692 | Transfection Reagent |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 11058-021 | Transfection Reagent |
| pBabe-X Myc-GATA4 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Hand2 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Mef2c | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X Myc-Tbx5 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-1 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X miR-133 | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| pBabe-X GFP | Plasmid containing reprogramming factor | ||
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma | H9268-5G | For viral induction. Use at a concentration of 6 µg/mL |
| Vacuum Filter + bottles (0.22 µm pores) | Nalgene | 569-0020 | For filtering media |
| Syringes | Bd Vacutainer Labware | 309654 | For viral filtration |
| 0.45 µm Filters | Celltreat | 229749 | For viral filtration |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | For MEF isolation and Flow Cytometry |
| Cytofix/Cytoperm Solution | BD | 554722 | For fixation and permeabilization of cells for flow cytometry |
| perm/wash buffer | BD | 554723 | For washing cells for flow cytometry |
| DPBS 1X | Gibco | 14190-250 | For washing cells |
| Bovine Serum Albumin | VWR | 0332-100g | For flow cytometry and calcium imaging |
| Goat Serum | Sigma | G9023 | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Donkey Serum | Sigma | D9663-10mg | For blocking cells for Flow Cytometry |
| Mouse Troponin T | Thermo Scientific | ms-295-p | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Mouse α-actinin | Sigma | A7811L | 1:400 IF, 1:200 Flow Cytometry |
| Rabbit Connexin 43 | Sigma | C6219 | 1:400 IF |
| Rabbit Troponin I | PhosphoSolutions | 2010-TNI | 1:400 IF |
| Hoechst | Life Technologies | 62249 | 1:10000 IF |
| Alexa 488, rabbit | Life Technologies | A-11034 | 1:800 IF |
| Alexa 555, mouse | Life Technologies | A-21422 | 1:800 IF |
| Alexa 647, mouse | Life Technologies | A-31571 | 1:200 Flow Cytometry |
| 27-color ZE5 Flow Cytometer | Bio-RAD | For FACS | |
| Paraformaldehyde | sigma | P6148-500mg | For fixing cells for IF |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | For permeabilization of cells for IF |
| EVOS™ FL Color Imaging System | Thermo Scientific | AMEFC4300 | For IF |
| NaCl | RPI | S23020-5000 | For calcium imaging |
| KCl | VWR | 395 | For calcium imaging |
| CaCl2 | Fisher | C614-500 | For calcium imaging |
| MgCl2 | VWR | 97061-352 | For calcium imaging |
| glucose | sigma | G7528-250g | For calcium imaging |
| HEPES | sigma | H4034-500g | For calcium imaging |
| Fura-2 AM | Life Technologies | F1221 | For calcium imaging |
| Fluronic F-127 | Sigma | P2443-250g | For calcium imaging |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | For disruption calcium transients in iCMs – use at 10 µM |
| Isoproterenol | sigma | I6504-1g | For increasing number of calcium transients in iCMs – use at 1-2 µM |
| Marianas Spinning Disk Confocal microscope | 3i | For calcium imaging | |
| ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| bleach | Clorox | ||
| 50 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 227261 | |
| 15 mL conical tubes | GREINER BIO-ONE | 188271 | |
| 15 cm cell culture dishes | Falcon | 353025 | |
| 10 cm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 60 mm cell culture dishes | GREINER BIO-ONE | 628160 | |
| 6 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| 12 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 665180 | |
| 24 well cell culture plates | GREINER BIO-ONE | 662160 |
Referencias
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