داخل الجمجمة سوباراتشنويدال الطريق للعدوى "أدوار التحقيق" للأغشية الحيوية العقدية الخنزيرية في التهاب السحايا في "نموذج العدوى الماوس"
Summary
هنا، يمكننا وصف مسار العدوى في الفئران لدراسة أدوار للأغشية الحيوية في التهاب السحايا العقدية الخنزيرية سوباراتشنويدال داخل الجمجمة. هذا النموذج الإصابة أيضا مناسبة لدراسة الآلية المرضية لالتهاب السحايا الجرثومي الأخرى ونجاعة أدوية جديدة لمكافحة التهاب السحايا الجرثومي.
Abstract
هو العقدية الخنزيرية الممرضات بكتيرية رئيسية الخنازير في جميع أنحاء العالم ليس فقط، بل أيضا وكيلاً الحيوانية ناشئة. في البشر والخنازير، التهاب السحايا مظهراً رئيسيا للالتهابات الخنزيرية . نموذج عدوى مناسبة أداة أساسية فهم آليات الأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة. وقد وضعت عدة طرق للعدوى في الفئران لدراسة الآلية المرضية للعدوى الخنزيرية . ومع ذلك، طرق العدوى داخل وداخل الآنف، وعن طريق الحقن الوريدي ليست مناسبة لدراسة دور كل من مكونات السطح الخنزيرية في التهاب السحايا مباشرة في الدماغ، مثل المصفوفة خارج الخلية من الأغشية الحيوية. على الرغم من أن التطعيم إينتراسيستيرنال قد استخدمت للإصابة الخنزيرية ، لا قد وصف موقع الحقن دقيقة. هنا، وصفت الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للإصابة في طراز ماوس للتحقيق في دور كل من الأغشية الحيوية في التهاب السحايا الخنزيرية . مباشرة تم حقن الخنزيرية العوالق الخلايا أو الخلايا الدولة بيوفيلم في الفضاء تحت العنكبوتية من الفئران عن طريق الحقن يقع روسترال من بريجما 3.5 ملم. تحليل نسيجية وزيادة التعبير مرناً من TLR2 والسيتوكينات من أنسجة المخ من الفئران حقن الخلايا بيوفيلم الدولة بينت بوضوح أن بيوفيلم الخنزيرية يلعب أدوار نهائية في التهاب السحايا الخنزيرية . هذا الطريق للعدوى ومزايا واضحة عبر طرق أخرى للعدوى، مما يتيح دراسة تفاعل البكتيريا المضيفة. وعلاوة على ذلك، فهو يسمح تأثير عناصر جرثومية على الاستجابات المناعية المضيف مباشرة في الدماغ لتقييم، ويحاكي مدخل البكتيرية في الجهاز العصبي المركزي. ويمكن تمديد هذا الطريق للعدوى للتحقيق وآليات لالتهاب السحايا الناجم عن بكتيريا أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدامه لاختبار فعالية العقاقير المضادة لالتهاب السحايا الجرثومي.
Introduction
العقدية الخنزيرية (الخنزيرية) هو الممرضات بكتيرية رئيسية الخنازير في جميع أنحاء العالم، مما تسبب في الأمراض الحادة بما في ذلك التهاب السحايا والالتهاب الرئوي وتسمم الدم، والتهاب الشغاف والتهاب المفاصل1. وأيضا عامل الحيوانية ناشئة. وحتى الآن، أفيد أن تسعة من اللقاح يمكن أن يسبب عدوى في البشر، بما في ذلك اللقاح 2 و 4، 5، 9، 14، 16، 21، 24 و 312،،من34. في البشر والخنازير، التهاب السحايا واحد من علامات سريرية رئيسية التهابات الخنزيرية . الخنزيرية في فيتنام وتايلاند، السبب الرئيسي لالتهاب السحايا في البالغين5. الأغشية الحيوية الميكروبية هي الكائنات المجهرية التي تنضم إلى بعضها البعض والتي تتركز في واجهة؛ أنها ضرورية لضراوة البكتيرية، والبقاء على قيد الحياة في بيئات متنوعة، ومقاومة المضادات الحيوية5. الأغشية الحيوية عادة محاطة مصفوفة خارج الخلية تحتوي عموما على السكريات والبروتينات والحمض النووي6. هذه الأخيرة غير قادرة على الحصول على استجابات المضيف التحريضية و إنتاج سيتوكين7. تشكيل بيوفيلم أبلغ أن تشارك في التهاب السحايا العقدية في الدراسات السابقة. الأغشية الحيوية المساهمة في التهاب السحايا العقدية اجالاكتيا في نموذج أسماك البلطي وتشكيل بيوفيلم تم كشف داخل أنسجة المخ وحولها سحائي السطوح في فيفو عن طريق التلقيح داخل البطن8. أثناء التهاب السحايا، العقدية الرئوية في دولة مثل بيوفيلم والبكتيريا في هذه دولة بيوفيلم كانت أكثر فعالية في حمل التهاب السحايا في نموذج9إصابة بماوس. وبالإضافة إلى ذلك، في أعمالنا السابقة دراسة، تسهم الدولة بيوفيلم المرتبطة الخنزيرية في الدماغ الماوس ضراوة البكتيريا ب تحليل البقاء على قيد الحياة10. ومع ذلك، أدلة مباشرة لمشاركة بيوفيلم في التهاب السحايا الخنزيرية تتطلب مزيدا من التحقيق.
وقد وضعت نماذج حيوانية للإصابة الخنزيرية في الفئران باستخدام داخل (القائمة)11،12من داخل الآنف (i.n.) وفي الوريد (رابعا)13وطرق العدوى14، إينتراسيستيرنال (جيم) 15 , 16-ومع ذلك، الطرق القائمة، و i.n.، ورابعاً للعدوى ليست مناسبة لدراسة دور كل من مكونات السطح الخنزيرية في التهاب السحايا في الدماغ مباشرة. وتشمل هذه المصفوفة خارج الخلية من الأغشية الحيوية. على الرغم من أن تم استخدام التطعيم جيم للإصابة الخنزيرية ، قد وصف موقع الحقن دقيقة لا في هذه الورقات. وفي المقابل، وصفت إحداثيات الموقع حقن التطعيم داخل الجمجمة سوباراتشنويدال ستيريوتاكسيك وضوح في دراسة سابقة17. هذا يسمح بالتعرف السهل نقطة التطعيم والبروتوكول التجريبي التبسيط أكثر. وباﻹضافة إلى ذلك، يحاكي الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى البكتيرية مدخل في الجهاز العصبي المركزي من الجيوب الأنفية أو الإذن الوسطى17، والعلاقة بين الإذن الوسطى والتهاب السحايا الناجم عن الخنزيرية وقد تجلت مادسن وآخرون18. وعلاوة على ذلك، بتطبيق التوجيه سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى في الفئران، لقد أظهرنا أن الخنزيرية الصغيرة رنا rss04 يسهم في التهاب السحايا في أعمالنا السابقة دراسة10.
في هذه الدراسة، استخدمت الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى في الفئران للتحقيق في دور كل من الأغشية الحيوية في التهاب السحايا الخنزيرية . كانوا مصابين الفئران العوالق الخلايا أو الخلايا الدولة بيوفيلم من الخنزيرية في هذا الطريق للعدوى. تحليل نسيجية وزيادة التعبير مرناً TLR2 والسيتوكينات من أنسجة المخ الفئران حقن الخلايا بيوفيلم الدولة بينت بوضوح أن بيوفيلم الخنزيرية يسهمان في التهاب السحايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
مسار سوباراتشنويدال داخل الجمجمة الإصابة الموصوفة هنا مزايا واضحة عبر طرق أخرى للعدوى. أنها تسمح للمحققين بدراسة تفاعل البكتيريا المضيفة وتأثير عناصر جرثومية على الاستجابات المناعية المضيف مباشرة في الدماغ، والتي تحاكي مدخل البكتيرية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، يمكن توسيع هذا الط…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل منح من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين [2017YFD0500102]؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية من الصين [31572544]؛ الدولة الرئيسية مختبر بيولوجيا مسببا البيطرية [SKLVEB2016KFKT005]؛ الزراعة شانغهاي تطبق تكنولوجيا تطوير البرنامج، الصين [G2016060201].
Materials
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
Referencias
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?. Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
