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Medicina

Isolamento de células-tronco intestinal e cultura em um modelo suíno de isquemia Intestinal pequena segmentar

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57647
, , ,
1Department of Clinical Sciences,North Carolina State University

Summary

Este protocolo permitirá aos leitores para estabelecer com sucesso um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar e posteriormente isolar e cultura de células-tronco para o estudo da reparação epitelial após lesão intestinais.

Abstract

Isquemia intestinal permanece das principais causas de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e veterinários. Muitos processos de doença resultam em isquemia intestinal, quando o fornecimento de sangue e, portanto, o oxigênio é diminuída para o intestino. Isso leva a perda da barreira intestinal e danos no tecido subjacente. Células-tronco intestinais residem na base das criptas de Lieberkühn e são responsáveis pela renovação intestinal durante a homeostase e seguir lesão. Ex vivo técnicas de cultura celular permitiram o estudo bem sucedido de interações de células-tronco epiteliais, estabelecendo as condições de cultura que suportam o crescimento dos sistemas de órgãos, como epiteliais tridimensionais (denominado “enteroids” e” colonoids”no intestino pequeno e grande, respectivamente). Estes enteroids são compostas de cripta e vilosidades, como domínios e maduro para conter todos os tipos de célula encontrados dentro do epitélio. Historicamente, murino modelos têm sido utilizados para estudar a lesão intestinal. No entanto, um modelo porcino oferece várias vantagens, incluindo a similaridade de tamanho bem como gastrointestinal anatomia e fisiologia dos humanos. Utilizando um modelo de suínos, estabelecemos um protocolo em que o segmentares loops de isquemia intestinal pode ser criado dentro de um único animal, permitindo o estudo de diferentes pontos de isquemia e reparar em vivo. Além disso, descrevemos um método para isolar e cultura de células-tronco intestinais dos loops isquêmicas do intestino, permitindo o estudo continuado de reparação epitelial, modulada por células-tronco, ex vivo.

Introduction

Isquemia intestinal, o resultado da disponibilidade de oxigênio diminuída devido a uma redução ou completa oclusão do fluxo sanguíneo para o intestino, continua a ser uma importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes humanos e animais,1,2. Danos isquêmicos, juntamente com a inflamação subsequente e infiltração celular, leva ao compromisso de barreira da mucosa. A barreira da mucosa é fundamental para a prevenção da translocação bacteriana e toxinas associadas para a circulação sistêmica3,4. A reperfusão subsequente dos tecidos isquêmicos pode resultar na formação de espécies reativas de oxigênio que podem agravar a lesão5de danificar. Desde que a isquemia intestinal é raramente evitável, mais atual pesquisa centrou-se na avançando técnicas para detecção precoce de isquemia e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que reduzem a reparação da mucosa lesão ou alvo de reperfusão.

Modelos animais têm sido amplamente utilizados para expandir o nosso conhecimento de ciência básica de lesões de isquémia-reperfusão e permanecem imperativo para investigação de translação. Modelos de roedores têm sido o mais utilizado devido à sua capacidade de ser geneticamente manipulada6. Mais recentemente, no entanto, o uso de modelos animais grandes, especificamente o porco, sido advogou para futuros estudos translacionais, devido a uma série de vantagens, incluindo as semelhanças anatômicas e fisiológicas de porcos para humanos7,8. Uma variedade de modelos de lesão foram desenvolvidos para estudar lesões de isquémia-reperfusão e incluem completa oclusão vascular, isquemia do low-flow e segmentar oclusão vascular mesentérica. Uma revisão completa destes modelos é fora do âmbito deste artigo, no entanto os autores direcionar os leitores para uma recente revisão3.

Além de modelos em vivo , o uso de sistemas de cultura celular ex vivo oferece uma ferramenta promissora para estudar a homeostasia intestinal e reparação após lesão. Células-tronco intestinais são responsáveis pela proliferação celular e o volume de negócios do revestimento epitelial intestinal. Quando isolada do intestino normal ou ferido, células-tronco intestinais podem ser mantidas em cultura e servir como uma ferramenta ou modelo para o estudo de células-tronco e biologia da célula epitelial. Métodos para isolar e estabelecer estas tridimensional cultura sistemas (denominados enteroids e colonoids quando derivado do intestino de pequeno e grande, respectivamente) foram descritos para uma variedade de espécies e órgão sistemas9,10 ,11,12,13. Especificamente, dentro do trato gastrointestinal, estes sistemas de cultura tem sido usado para doença gastrintestinal modelo, incluindo câncer, infecção do patógeno e de doença inflamatória intestinal14. Neste momento, não existem relatos descrevendo o isolamento e manutenção de células-tronco intestinais do intestino delgado ischemically ferido em qualquer espécie. Portanto, aqui descrevemos o processo de isquemia intestinal em um modelo de suínos animal novela, grande que resulta em lesão reprodutível e a capacidade de isolar células-tronco intestinais do intestino normal e ischemically ferido para o estudo adicional de recuperação ex vivo.

Protocol

Para estas experiências, todos os estudos em animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade Estadual da Carolina do Norte. 1. preparação para cultura Nota: Todos os reagentes estão listados na Tabela de materiais. Concentrações de fator de crescimento específicos estão listadas na tabela 1. Prepare uma solução de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M em água destilada, deionizada (ddH2O). Misture adequadamente e ajustar o pH para 7,4 usando soluções de NaOH ou HCl.Nota: Compõem a solução estoque de EDTA fresco antes de cada experimento. Preparar o reagente de dissociação #1 (DR #1) da seguinte forma e colocar no gelo: tampão fosfato combinam salino sem Ca2 + e Mg2 + (PBS), 0,5 M de EDTA, 1 M 1,4-ditiotreitol (DTT), 10 µM Y27632 e 1 solução X antibiótico-antimicótico (anti-Anti) contendo penicilina, estreptomicina e anfotericina b.Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido. Preparar o reagente de dissociação #2 (DR #2) da seguinte forma e coloque em banho maria a 37 ° C: combinar PBS sem Ca2 + e Mg2 +, EDTA 0,5 M, 10 µM Y27632 e 1 X anti-Anti. Nota: Adicione Y27632 imediatamente antes da coleta de tecido. Preparar a mídia de células-tronco epiteliais intestinais (Iguatemi) como segue: Mix 25 mL avançado meio DMEM/F12 com 1 suplemento N2 X, 1 X B-27 suplemento, 10 mM HEPES, 2mm Glutamax e 1 X anti-Anti. Armazenar a 4 ° C até o uso. Preparar uma mistura mestre de fator de crescimento reduzido da membrana basal matriz (matriz) e fatores de crescimento suplementares da seguinte forma: descongelar a matriz no gelo. Em um tubo de microcentrifugadora, adicionar 100 ng/mL Noggin humana recombinante, 500 ng/mL recombinante humana R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a humana recombinante, 10mm nicotinamida, 10 gastrina nM, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , SB202190 de 10mm, 500 nM LY2157299 e inibidor de quinase 3 de 2,5 µM glicogénio sintase (GSK3i, CHIR99021). Quando a matriz é descongelada, completar com a mistura de fator de crescimento (fazendo a mistura de mestre) e armazenar no gelo.Nota: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar como isto irá criar artefato dentro a patty matriz durante o chapeamento. Pré-aquecer um prato de cultura de tecidos de 24-poço em uma incubadora de 37 ° C antes de iniciar os procedimentos de isolamento de célula. 2. cirúrgico modelo de isquemia e coleção de tecido Uso de oito a dez semanas Yorkshire mestiços porcos de ambos os sexos (recomendado). Retire todos os alimentos 16-18 h antes da cirurgia. Os porcos permita o acesso à água em todos os momentos. Agendar os porcos a chegar pelo menos 48 horas antes dos experimentos para permitir a aclimatação ambiental.Nota: Técnicos treinados, veterinária e/ou laboratório, supervisionados por um veterinário licenciado fornecem assistência com procedimentos anestésicos e cuidados de rotina animal. Pré-medicar o porco com xilazina (1,5 mg/kg por via intramuscular (IM)) e cetamina (11-20 mg/kg (IM))15. Uma vez sedada, entube o porco orotracheally. Manter porcos sob anestesia geral com isoflurano (2-5%) vaporizado em 100% O2 até o momento da eutanásia. Coloque um cateter de (IV) por via intravenosa (veia de orelha recomendado) e administrar um fluido de substituição, tal como a solução de lactato de toques em uma taxa de manutenção de 15 mL/kg/h. Execute rotina anestésica monitorização incluindo oximetria de pulso, eletrocardiografia e medições de pressão indirecta15. Monitorar a frequência respiratória e esforço do porco e ventilar manualmente ou mecanicamente conforme necessário se final das marés CO2 sobe acima de 55-60 mmHg.Nota: Anestesia adequada é confirmada pela monitorização contínua das tendências na frequência cardíaca (faixa 80-130 batimentos/min), pressão arterial não-invasiva (média pressão arterial 75-100 mmHg) e frequência respiratória (respirações por minuto 10-25)16e verificação periódica pela ausência de mandíbula e Tom anal. Profundidade da anestesia também pode ser julgada pelo grau de relaxamento muscular e fasciculação muscular após estímulo cirúrgico. Reflexos oculares são geralmente de nenhum valor16. Analgesia pode ser fornecida como dirigido pela política IACUC instituições. Neste caso, um opioide, como a buprenorfina, pode ser administrado durante a cirurgia. Coloque o porco em uma almofada de aquecimento e frear em prostração dorsal para o procedimento cirúrgico. Raspar o abdômen ventral e preparar usando esfoliante cirúrgico (solução de clorexidina) e álcool isopropílico. Fazer uma incisão de 8-10 cm da linha média ventral, usando uma lâmina de bisturi centralizada no umbigo para acessar o abdômen. Identifica o oral de aproximadamente 40 cm de intestino delgado (jejuno) até a junção ileocecal. Delinear a longos loops de 10 cm de jejuno por circunferencialmente, ligando o intestino duas vezes, um cm entre cada ligadura, antes da criação subsequente loops 10cm localizado por via oral (Figura 1). Crie dois loops por ponto de tempo de isquemia adjacentes um ao outro, um para isquemia e outro para isquemia com h 1 adicional de reperfusão se desejado. Para criar a isquemia completa (sem fluxo de artérias ou veias), braçadeira ou ligate vasculatura mesentérica usando pinças vasculares buldogue, curvados hemostatos de Halstead mosquito ou fio não absorvível 2-0 para 1, 2, 3 e 4h e em seguida, retire as braçadeiras para 1h de reperfusão, se desejado.Nota: Os autores criado todas loops de isquemia em ordem, começando com o loop isquêmica 4h e progrediram movendo-se proximalmente (para minimizar o tempo total de cirurgia). Para lidar com a possibilidade de que vizinhos isquêmicos segmentos intestinais podem danificar loops adjacentes, a ordem das argolas isquêmicas pode ser variada. Isso pode alterar o tempo cirúrgico total.Nota: O tempo de reperfusão pode ser variado baseado sobre a questão de pesquisa de interesse ou se terapias desejam ser testados durante o período de reperfusão. No entanto, como dano tecidual torna-se mais grave do aumento da duração da isquemia sozinha, lesão de reperfusão provável não contribui para mais lesão epitelial. Reperfusão provavelmente um papel suaves períodos de isquemia a seguir. Entre os pontos de tempo de isquemia, manter o abdômen cobertos ou fechados usando uma toalha estéril e/ou uma pinça de toalha.Nota: Dentro de um único animal para este experimento, oito segmentos isquêmicos podem ser criados. Identifica um segmento jejunal adicional, pelo menos 5-10 cm proximal ao último loop isquêmica, que servirá como um controle interno normal. Obstrua aproximadamente três vasos mesentéricos por pinça vascular buldogue ou pinça hemostática de mosquito curvada Halstead. Deve ter cuidado durante a aplicação da pinça hemostática porque os vasos são facilmente traumatizados. Tente empilhar os vasos dentro as mandíbulas dos grampos. No final do experimento, seguir eutanásia com pentobarbital 85-100 mg/kg IV, colete todos os laços de tecido, usando a tesoura de metzenbaum, após a morte foi confirmada sem batimento cardíaco auscultado e perda do reflexo corneal. Comece por recolher um pedaço de controle de jejuno normal pelo menos 5 – 10 cm proximal ao último loop isquêmica. Separar e armazenar os loops de cada ponto de tempo de lesões em pequenos recipientes de PBS gelado até que esteja pronto para isolamento de cripta.Nota: Se desejar, faça isquêmica loops de tempo suficiente para dividir em amostras separadas para histologia e cultura de células-tronco intestinal; no entanto, os autores descobriram que loops superiores a aproximadamente 10 cm de comprimento são mais prováveis tornar-se hemorrágica. 3. a cripta (células-tronco) isolamento de isquemia e malhas de controle Inverta a cada loop do intestino pequeno usando um fio de calibre 20 e fórceps do tecido para expor a superfície da mucosa. Amarre a parte superior e inferior do loop firmemente ao fio usando sutura (seda não absorvível 2-0 ou equivalente). Após inversão, enxágue cada loop em gelo frio PBS para remover detritos luminal. Colocar as amostras imediatamente nos tubos cónico de 50 mL contendo DR #1 no gelo por 30 min. Coletar loops começando com controle e siga com loops de aumentar incrementalmente durações de isquemia. Loops de menos tecido danificado (ou seja, controle e 1h isquêmica dos tecidos) podem ser abalados com força, encaixe o pulso para obter melhores resultados. Os tecidos de tecido severamente danificado (3 e 4 h de isquemia) devem ser suavemente bombou ou invertidos apenas como muita agitação causará cripta perturbação e destruição de tecido adicional. Os tubos devem ser abalados ou invertidos a cada 5 min enquanto no gelo. Transferi as amostras para DR #2 por 10 min em banho maria a 37° C. Agitar ou inverter os tubos a cada 5 min. Após a transferência dos tecidos, centrifuga os tubos cónicos contendo DR #1 a partir dos loops de 2-4 h danificado para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que criptas já tem se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9. Retire amostras do DR #2 e colocar as amostras de tecido diretamente em 25 mL de PBS frio no gelo (rótulo como lavagem #1). Coloca as amostras em um agitador orbital no gelo em 60 rpm. Continuar a agitar ou inverter cada tubo por 30 s cada 2 a 5 min. Após a transferência dos tecidos, rotação dos tubos cónicos contendo DR #2 da 2-4 h danificado loops para remover o sobrenadante de EDTA (200 x g por 5 min). Estes tecidos são altamente danificados é possível que as criptas têm se tornar dissociadas. Remover o sobrenadante e ressuspender com um pequeno volume de PBS (5 mL) e avance para o passo 3.9. Retire uma alíquota de 50 μL de lavagem #1 (ou do DR) para verificar o grau de dissociação da cripta e a quantidade de detritos. Coloque o tecido em um novo tubo cónico de 50 mL (lavagem #2, #3, etc.) preenchido com 25 mL de frio PBS e agitar até criptas intactas são isoladas com detritos mínimo e vilosidades.Nota: O objetivo é ser capaz de isolar uma fração limpa com criptas intactas e detritos mínimo. Cada lavagem adicional limpará as células no entanto muita agitação começa a resultar em danos de tecidos/células secundárias. Além disso, os melhores resultados com menos contaminação serão alcançados se criptas são banhadas de uma etapa de lavagem e não de uma etapa de reagente de dissociação. Remover o tecido remanescente e centrifugar os tubos cónico de 50 mL a 200 x g durante 5 minutos para remover o sobrenadante e, em seguida, resuspenda restantes a pelota cripta em menor volume de PBS (5 mL). Usando um microscópio invertido, examine 50 alíquotas µ l de cada amostra para determinar o número de criptas/fração. O objetivo é 50-100 µ l de criptas/50, já que este será o tamanho da patty a matriz final.Nota: Se a amostra for muito concentrada, continue a adicionar PBS frio até a concentração desejada é alcançada. Se a amostra é muito diluída, determine o número de alíquotas necessárias para atingir o rendimento desejado cripta e ajustar. Alíquota volumes adequados de criptas (determinadas por observações alíquotas) em um tubo de microcentrifugadora. Por exemplo, se a amostra contém 50 µ l de criptas/50, em seguida, alíquota de 50 μL por patty Replica X 3 = 150 µ l / microcentrifuga tubo. Se a amostra contém apenas 25 µ l de criptas/50, em seguida, 2 alíquotas necessárias / patty X 3 Replica = 300 µ l/tubo. Criptas de pelota a 200 x g por 5 min a 4° C. Resuspenda suavemente criptas peletizadas com volume apropriado do mestre mix (50 μL por poço). Misture bem, pipetando rapidamente 15 vezes sem criar bolhas de ar.Nota: Pré-fixe a ponta da pipeta com PBS estéril frio antes de aspirar a mistura de mestre. Isto ajudará a manter a mistura de mestre de espalhar para fora. Dicas também podem ser mantidas na geladeira e colocadas no capô imediatamente antes da utilização. Dispense uma mistura mestre µ l 50 além de gotículas cripta em centro de cada poço da placa 24 bem pré-aquecido. Incubar a placa de cultura por 30 min a 37 ° C. Sobreposição de cada patty de matriz com 500 µ l / bem de mídia da Iguatemi (sem fatores crescimento adicionais necessários no dia 0, como eles estão contidos o mestre mix). Adicione 500 µ l PBS estéril qualquer poços não utilizados que deixou no prato para manter a umidade. Contar o número de criptas chapeados no dia 0.Nota: É útil para pré-grade cada célula cultura placa em quadrantes para ajudar a garantir a contagem mais precisa. Contar o número de enterospheres cada 24 h e monitorar para desenvolvimento de enteroid diariamente. Adicione fatores de crescimento para cada bem cada 48 h. Remova a mídia do Iguatemi cada 96 h e substituir com mídia de fresco 500 µ l (fatores de crescimento devem então ser adicionados à mídia).

Representative Results

Isquemia intestinal completa foi criada em pequenas loops intestinais utilizando oclusão vascular com suturas ou grampos, como mostrado na Figura 1. Soltando os grampos, um período controlado de reperfusão pode ser realizado, permitindo estudo adicional de lesão de reperfusão subsequente se desejado. Todos os animais sobreviveram durante o procedimento com mínima complicação até eutanásia. A complicação cirúrgica mais comum foi a hipotensão, que possa ser resolvido com a suplementação de um inotrope positivo como a dobutamina. Se executada corretamente, lesão isquêmica começará a ponta das vilosidades intestinais e migrar para baixo dentro da cripta, como a duração dos aumentos de isquemia (Figura 2). Um erro comum com a técnica cirúrgica pode ocorrer quando os vasos sanguíneos não são ligados ou fixados uniformemente. O resultado é uma isquemia hemorrágica (Figura 3), em que a veia de paredes finas recolhe antes da artéria, permitindo a sangue adicional para se infiltrar nos tecidos. Isto é visto grosseiramente como uma escura púrpura serosas superfície (Figura 3, à esquerda) em comparação com uma superfície mais pálida durante a isquemia completa (Figura 3, direita). Após a remoção das argolas intestinais isquêmicas, criptas intestinais foram com sucesso isoladas seguindo o protocolo de dissociação (Figura 4). Como esperado, criptas de momentos mais severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. Durante o protocolo, intestino gravemente ferido deve ser agitado suavemente para evitar danos adicionais ao tecido subjacente. Demasiado aproximadamente tremer pode resultar em novos danos de cripta e a maioria das criptas terminando no DR de soluções contendo EDTA, resultando em perturbações adicionais. Uma vez chapeado, criptas de todos os pontos de tempo de isquemia sobrevivem e são capazes de se estabelecer na cultura (Figura 5). Quando normais e levemente danificadas criptas intestinais são banhadas em cultura, formulário de enterospheres dentro de 24-48 h. Com severos danos isquêmicos (h de 3 e 4), as criptas intestinais sobrevivem mas são danificadas, resultando na formação de esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. Em geral, há uma eficiência de crescimento diminuiu de criptas, bem como um diminuição da tamanho de enteroids, derivado do tecido intestinal severamente danificado (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017). Figura 1 : Modelo cirúrgico da isquemia intestinal completa em um modelo porcino. A) normal jejuno porcino exteriorizado. B) mesentéricos vasos tem sido ligados com sutura criando isquemia intestinal. C) isquemia criada usando pinças vasculares buldogue para permitir a reperfusão do tecido se desejado. D) intestinal vasculatura imediatamente após a remoção dos grampos vasculares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 : Evidência histológica (hematoxilina e eosina (H & E) mancha) de aumentar dano epitelial após períodos mais longos de isquemia intestinal completa. Dano começa na ponta das vilosidades com perda gradual da camada epitelial simples célula, embotamento das vilosidades e dano celular, estendendo-se até a cripta de base com ferimentos graves (até 4 h de duração). barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Evidência bruta e histológica de isquemia hemorrágica. A) bruta fotografia comparando isquemia hemorrágica (laço à esquerda) e isquemia completa (loop de direito). Quando a vasculatura não é ligada ou fixada uniformemente, sangue pode continuar a se infiltrar nos tecidos, resultando em danos e inflamação adicional. B) H & E imagens de isquemia hemorrágica de aumentar a duração de 1-4 h. Além do dano celular visto com isquemia completa, há indícios de infiltração de células vermelhas do sangue dentro da propria do lamina circundante. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Alíquotas de criptas intestinais isoladas de loops do intestino isquêmico e normal. Completas, intactas criptas intestinais (asteriscos) foram isoladas com êxito de cada loop do intestino. Como esperado, criptas de mais pontos de tempo severamente danificados, muitas vezes foram quebradas (f; fragmento) e frações de cripta continham mais restos celulares do plano de fundo quando comparado com aqueles que passaram por n ou dano brando. barra de escala de 100 µm. Eu = isquemia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 : Curso de tempo do crescimento de células-tronco intestinal após o isolamento de loops isquêmicas do intestino delgado. Quando normais criptas intestinais foram banhadas em cultura, enterospheres formado dentro de 24-48 h. Com graves danos isquêmicos (h de 3 e 4), criptas sobrevivem mas formam esferas muito menores inicialmente. Por 72-120 h, enteroids se tornam mais complexas com lúmens centrais óbvios e estruturas de brotamento. 20 µm escala bar a menos que indicado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Fator de crescimento Diluente de Concentração das ações Diluição Diluição de trabalho R-Spondin PBS 100 X 100 µ g/ml 1 µ g/ml Cabeça SW/0.1%BSA 1000 X 100 µ g/ml 100 ng/ml FEG 10mM de ácido acético 10.000 X 500 µ g/ml 50 ng/ml A-83-01 DMSO 1000 X 500 ΜM 500 nM SB202190 DMSO 3000 X 30 mM 10 ΜM Nicotinamida SW 1000 X 1 M 1 mM Gastrina PBS 10.000 X 100 ΜM 10 nM Y-27632 PBS 1000 X 10 mM 10 ΜM LY2157299 DMSO 10.000 X 5 mM 0,5 ΜM CHIR99021 PBS 1000 X 2,5 mM 2,5 ΜM Wnt3a PBS 2000 X 200 µ g/ml 100 ng/ml Tabela 1: tabela de fator de crescimento reagente. Resumo das soluções estoque de fator de crescimento e soluções de trabalho utilizados no presente protocolo.

Discussion

O desenvolvimento de um modelo suíno de isquemia intestinal segmentar expande-se sobre modelos anteriores murino, permitindo o estudo de vários pontos de tempo de lesões no tecido dentro do mesmo animal. Há vários pontos de discussão crítica do presente protocolo, incluindo ligadura do vaso adequado, reperfusão de tecido e cultura de células da cripta bem sucedida.

Ligadura da embarcação adequada é essencial para a criação de um modelo de isquemia completa. Se a sutura é amarrada desigual ou a braçadeira não apertado completamente, o sangue de artéria paredes espessas pode continuar a entrar no tecido e não é possível sair devido ao colapso da veia de paredes finas. Isso resulta em extravasamento de sangue para a propria do lamina causando dano tecidual adicional. No entanto, dependendo do tipo de lesão isquêmica sendo estudado, isquemia completa ou hemorrágica pode ser desejada. Por exemplo, no processo de transplante intestinal, o intestino é completamente separado do suprimento vascular (artéria e veia) durante a fase de ressecção do processo, o que resulta em isquemia intestinal completa. Como alternativa, no entanto, quando o mesentério é torcido durante um evento como um Volvo intestinal, o retorno venoso é muitas vezes obstruído em primeiro lugar, levando a sangue adicional dentro do tecido antes de ser o suprimento arterial obstruído, criando assim hemorrágica, isquemia.

Lesão isquêmica resulta em danos aos tecidos, começando na ponta das vilosidades e estendendo-se até à base da cripta3. Durante a isquemia, energia sob a forma de trifosfato de adenosina continua a ser usado e gera a hipoxantina metabólito. Quando o tecido é perfundido com oxigênio, hipoxantina se torna metabolizada pela xantina oxidase e produz radicais livres superóxido, levando a lesão da mucosa e atração do tecido, danificando os neutrófilos17,18. Diferenças de espécie em arquitetura vascular da mucosa, bem como de expressão variado de xantina oxidase, resultar em diferentes graus de lesão de reperfusão3. Modelos de felinos e roedores de isquémia-reperfusão são mais suscetíveis à lesão de reperfusão de metabólitos de oxigênio reativo19,20. Em contraste, os porcos foram encontrados para ter menos xantina oxidase e, portanto, menor lesão de reperfusão, tornando este modelo mais comparável de isquemia intestinal humano21. Neste momento, o uso de nocaute ou modelos suínos transgênicos para estudar a lesão intestinal não foi descrito, tornando isso uma grande limitação deste modelo. Seleção do modelo adequado de animais varia de acordo com o processo da doença ou condição específica o pesquisador deseja estudar. Por exemplo, modelos suínos de isquemia até 6 h tem sido descrito22, Considerando que procedimentos mais isquêmicos murino modelos são de 45-60 min23.

Bem sucedida isolação das criptas intestinais do intestino normal e ischemically danificado permite que para o estudo de recuperação epitelial em cultura. Este sistema permite que o pesquisador focar exclusivamente o epitélio sozinho, como não há suprimento não vascular ou componente de células imunes a considerar. Isso oferece a oportunidade de estudar as interações de células epiteliais e recuperação após lesão além da resposta a diferentes fatores de crescimento, ou tratamentos administrados durante a cirurgia ou isolamento de cripta seguintes, completando os meios de cultura. Esta etapa permanece o mais difícil, como isolamento de loops severamente danificados requer agitação suave e rápida remoção das soluções contendo EDTA no caso de criptas tornam-se prematuramente dissociados. Se essas voltas do intestino não são lavadas, criptas têm o potencial de tornar-se contaminado na cultura. Como resultado, solução de antibiótico antimicótico foi adicionada para ambas as soluções DR além da mídia de Iguatemi. Outro ponto de discussão centra-se no intestino coletado como um controle normal. Como os animais se submeter a anestesia com possíveis alterações na perfusão do tecido sistêmico, juntamente com a possibilidade de circular mediadores inflamatórios secundários à isquemia, tecido de controle mesmo “normal” não pode representar um verdadeiro controle. Nesses experimentos, é digno de nota que o tecido de controle apareceu grosseiramente e histologicamente comparável ao tecido de animais que não sofreu isquemia em outras experiências (Gonzalez, L.M., dados não publicados, 2017).

Em resumo, este método descreve um modelo reproduzível de isquemia intestinal porcina, que modela de perto o que ocorre na isquemia humana. Além disso, o isolamento de células-tronco intestinais de loops isquêmicas é descrito, que serve para estudar a reparação epitelial e possível resposta ao tratamento na cultura.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projecto foi apoiado pelo NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 e Dept. de ciências clínicas divulgação fundos

Materials

Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free Fisher Scientific  BP-399 Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O) Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Scientific 20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED45 Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 646563
Y-27632 Sigma Aldrich Y0503
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
N2 Supplement Life Technologies 17502-048
B-27 Supplement Life Technologies 12587-010
HEPES Life Technologies 15630-106
Glutamax Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Gibco 15240-096 Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a R & D Systems 5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1 R & D Systems 4645- RS
Recombinant human Noggin R & D Systems 6057-NG
Recombinant human EGF R & D Systems 236-EG
LY2157299 SelleckChem 52230
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
Human [leu]15-Gastrin 1 Sigma Aldrich G9145
SB202190 Sigma Aldrich 57067
A83-01 Tocris 2939
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Water, WFI Quality Corning, Inc. 25-055-CM Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Matrigel Matrix, GFR Corning, Inc. 356231 Phenol red free
24 Well Culture Dish Corning, Inc. 3524
Conical Tube, 50 ml  Corning, Inc. 430828
Scalpel Handle World Precision Instruments 500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 World Precision Instruments 504169
Tissue Forceps World Precision Instruments 15918
Debakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501239
Mayo Scissors World Precision Instruments 501752 Curved or straight
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments 501739
Mosquito Forceps, Curved World Precision Instruments 503724-12 Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp Stoelting Co. 52120-40P Straight
Silk, 2-0  Henry Schein 685S-BUT Any similar brand is acceptable
Towel Clamps World Precision Instruments 501700
Needle Holder World Precision Instruments V503382
Wire suture, 20 gauge Henry Schein 19075 Cut and straighten before use.
Surgical Towels Henry Schein ST1833 Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution Henry Schein 9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%) Henry Schein VINV-CHMX-SCRB Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70% Henry Schein MS071HS Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge Henry Schein 2225PUR May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml) Henry Schein 33198
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 11695-6835-1 Controlled medication
Isoflurane solution Henry Schein 10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) Vortech Pharm. Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad  Gaymar Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor Mindray North America Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer  Vetland Medical Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump Abbott Hospira Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.
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Referencias

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Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia. J. Vis. Exp. (135), e57647, doi:10.3791/57647 (2018).
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