JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Bağırsak kök hücre izolasyon ve Segmental küçük bağırsak iskemi, domuz bir modeli kültür

Published: May 18, 2018
doi:
10.3791/57647
, , ,
1Department of Clinical Sciences,North Carolina State University

Summary

Bu iletişim kuralı okuyucuların başarıyla gelen bir segmental intestinal iskemi domuz bir model kurmak ve daha sonra yalıtmak ve bağırsak kök hücreleri epitelyal onarım yaralanma aşağıdaki çalışma için kültür sağlayacaktır.

Abstract

Önemli bir nedeni, morbidite ve mortalite insan ve hayvan hastalıklarıyla ilgili hastalarda intestinal iskemi kalır. Kan akımı ve bu nedenle oksijen azalmıştır bağırsak için birçok hastalığı süreçleri intestinal iskemi neden. Bağırsak bariyer kaybı ve hasar için temel alınan doku bu götürür. Bağırsak kök hücre Lieberkühn kriptalarının tabanında bulunan ve homeostasis ve aşağıdaki yaralanma sırasında bağırsak yenilenmesi için sorumludur. Ex vivo hücre kültürü teknikleri üç boyutlu epitel organ benzeri sistemlerde büyümeyi desteklemek kültür koşulları kurarak epitel kök hücre etkileşimleri başarılı çalışma için izin (“enteroids” olarak adlandırılan ve” colonoids”küçük ve büyük bağırsak, sırasıyla). Bu enteroids crypt ve villus benzeri etki alanları oluşmaktadır ve olgun epitel içinde bulunan hücre türlerini içerecek. Tarihsel olarak, fare modelleri bağırsak yaralanma çalışmaya yeniden kullanılmıştır. Ancak, bir domuz modeli benzerlik boyutu gibi gastrointestinal anatomi ve Fizyoloji olan insanlar için de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Bir domuz modeli kullanarak, biz hangi intestinal iskemi gelen bir segmental döngüler içinde tek bir hayvan-ebilmek var olmak mahluk, farklı çalışma etkinleştirme puan iskemik yaralanma zaman ve içinde vivoonarmak bir protokol kurmak. Ayrıca, epitel tamir, kök hücreleri tarafından modülasyonlu sürekli çalışma için izin yalıtmak ve bağırsak, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden kültür için bir yöntem tarif ex vivo.

Introduction

Bağırsak iskemik yaralanma, azalmış oksijen durumu bir azaltma veya bağırsak, kan akışını tam tıkanıklığı nedeniyle sonucu kalır morbidite ve mortalite insan ve hayvan hasta1,2önemli bir nedenidir. Sonraki inflamasyon ve hücresel infiltrasyon, birlikte iskemik hasar mukozal bariyer uyuşmazlığına yol açar. Mukozal bariyer bakteriyel translocation ve ilişkili toksinler önleme sistemik dolaşım3,4içine için çok önemlidir. İskemik doku sonraki reperfüzyon hasarı5azdırmak reaktif oksijen türlerine zarar verme oluşumuna neden. İntestinal iskemi nadiren önlenebilir olduğu için en güncel araştırma teknikleri iskemi erken teşhis ve reperfüzyon hasarı veya hedef mukozal onarım azaltmak yeni tedavi yaklaşımları gelişimi için ilerleyen üzerinde odaklanmıştır.

Hayvan modelleri kapsamlı iskemi-reperfüzyon hasarı temel bilim bilgimizi genişletmek ve translasyonel araştırma için şart kalmak için kullanılmaktadır. Kemirgen modelleri en çok kullanılan yeteneklerini genetik olarak işlenmiş6olması nedeniyle olmuştur. Son zamanlarda ancak, özellikle domuz, büyük hayvan modellerinin kullanımı nedeniyle bir çok avantaj insanlar7,8domuz anatomik ve fizyolojik benzerliklerinden dahil olmak üzere gelecek translasyonel etütler savunduğu. Yaralanma modelleriyle iskemi-reperfüzyon hasarı çalışma ve tam damar tıkanıklığı, düşük akım iskemi ve segmental mezenterik damar tıkanıklığı için geliştirilmiştir. Bu modellerin tam bir inceleme Ancak yazarlar son bir daha gözden geçirme3okuyucularına doğrudan bu makalenin bölge dışında var.

Vivo modelleri yanı sıra, ex vivo hücre kültür sistemlerinin kullanımı bağırsak homeostazı ve yaralanma takip onarım çalışmaya gelecek vaat eden bir araç sunar. Bağırsak kök hücre hücresel proliferasyonu ve ciro Bağırsak epitel astar için sorumludur. Ne zaman normal ya da yaralı bağırsak izole, bağırsak kök hücre kültüründe korunabilir ve bir aracı veya kök hücre ve epitel hücre biyolojisi çalışmaya modeli olarak hizmet. İzole etmek ve bunlar üç boyutlu kurmak için yöntemler kültür sistemleri (enteroids ve ne zaman küçük ve büyük bağırsak sırasıyla türetilmiş colonoids olarak adlandırdığı) türler ve organ sistemleri9,10 çeşitli için tarif var ,11,12,13. Özellikle, gastrointestinal sistem içinde modeli gastrointestinal hastalık kanser, patojen enfeksiyon ve iltihabi bağırsak hastalığı14dahil olmak üzere bu kültür sistemleri kullanılmıştır. Şu anda yalıtım ve bağırsak kök hücrelerden ischemically yaralı bağırsakta herhangi bir tür bakımından açıklayan hiçbir raporlar vardır. Bu nedenle, burada biz modelindeki tekrarlanabilir yaralanma ve yeteneğini ek çalışma için normal ve ischemically yaralı bağırsak bağırsak kök hücreleri izole etmek neden olan bir roman, büyük hayvan domuz intestinal iskemi süreci tanımlamak Kurtarma ex vivo.

Protocol

Bu deneyler için tüm hayvan çalışmaları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. kültür için hazırlık Not: Tüm reaktifler Malzemeler tablolistelenir. Belirli büyüme faktörü konsantrasyonları Tablo 1′ de listelenmiştir. 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltilerine saf deiyonize su (GKD2O) hazırlayın. Yeterince mix ve pH 7.4 NaOH ve/veya HCl çözümleri kullanarak için ayarlayın.Not: EDTA hisse senedi çözüm kadar her deneme önce taze olun. Ayrılma reaktif #1 (DR #1) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer buza: birleştirin fosfat tamponlu serum Ca2 + ve Mg2 + (PBS), 0,5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X antibiyotik Antimycotic çözüm (Anti-Anti) Penisilin, streptomisin ve amfoterisin b içerenNot: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin. Ayrılma reaktif #2 (DR #2) aşağıdaki gibi hazırlamak ve yer bir 37 ° C su banyosunda: birleştirmek PBS Ca2 + ve Mg2 +, 0,5 M EDTA, 10 µM olmadan Y27632 ve 1 X Anti-Anti. Not: Y27632 hemen doku toplama önce ekleyin. Aşağıdaki gibi bağırsak epitel kök hücre (IESC) ortam hazırlamak: Mix 25 mL 1 X N2 ek ile DMEM/F12 Orta İleri, 1 X B-27 ek, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax ve 1 X Anti-Anti. 4 ° C’de kullanmak kadar saklamak. Aşağıdaki gibi düşük büyüme faktörü membran matris (matrix) ve tamamlayıcı büyüme faktörleri ana karışımı hazırlar: matris buz çözme. Bir microcentrifuge tüp 100 ng/mL eklemek rekombinant insan kafa, 500 ng/mL rekombinant insan R-Spondin 1, 50 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 100 ng/mL rekombinant insan Wnt3a, 10 mM nikotinamid, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 ve 2.5 µM glikojen sentaz 3 kinaz inhibitörü (GSK3i, CHIR99021). Matrix çözdürülen (ana mix yapma) büyüme faktörü karışımı ile ek ve buz üzerinde depolamak.Not: Bu kaplama sırasında artifakı içinde matris patty yaratacak gibi hava kabarcıkları tanıtımı önlemek dikkatli olun. 24-iyi doku kültürü çanak hücre izolasyon yordamları başlatmadan önce 37 ° C kuluçka önceden ısıtmak. 2. cerrahi modeli iskemi ve doku Takibi Kullanım sekiz on haftalık Yorkshire için (önerilen) her iki cinsiyetten domuzlar olacak. Ameliyat öncesi tüm yem 16-18 h kaldırın. Domuzlar her zaman su erişimine izin verir. Varmak için domuz zamanlamak en az 48 saat önce deneyler için çevre calıştıkları izin vermek için.Not: eğitimli veteriner ve/veya Laboratuvar teknisyenleri lisanslı bir veteriner tarafından denetimli rutin hayvan bakımı ve anestezik yordamları ile ilgili yardım sağlar. Xylazine domuzla premedicate (1.5 mg/kg intramüsküler (IM)) ve ketamin (11-20 mg/kg (IM))15. Sonra kullanan kişi, domuz orotracheally tüp takacağım. 0 O2 ötenazi zamana kadar buharlaşmış isoflurane (% 2-5) ile genel anestezi altında domuz korumak. Bir intravenöz (IV) kateter (önerilen kulak ven) yerleştirin ve bir yedek sıvı lactated ringers çözüm 15 mL/kg bakım oranında gibi yönetmek/s. Rutin Nabız oksimetri, elektrokardiyografi ve dolaylı tansiyon ölçümleri15de dahil olmak üzere izleme anestezik gerçekleştirin. Domuzun solunum hızı ve çaba izlemek ve el ile veya bitiş tidal CO2 55-60 mmHg üzerinde çıkarsa gerektiği gibi mekanik havalandırın.Not: Uygun anestezi kalp hızı (aralığı 80-130 atım/dk), non-invaziv kan basıncı (ortalama arter basıncı 75-100 mmHg) ve solunum hızı (10-25 nefes/dak)16ve periyodik kontrol eğilimlerin sürekli izleyerek doğrulanır çene ve anal sesi olmaması için. Anestezi derinliği derecede kas gevşemesi ve kas fasciculation cerrahi uyarıcı takip tarafından değerlendirilecektir olabilir. Oküler reflekslere genellikle hiçbir değeri16tane vardır. Analjezi kurumlar IACUC ilkesi tarafından belirtilen şekilde sağlanabilir. Bu durumda, buprenorfin gibi bir opioid ameliyat sırasında yönetilebilir. Domuz ısıtma yastığını yerleştirin ve dorsal recumbency cerrahi işlem için dizginlemek. Ventral karın tıraş ve cerrahi scrub (klorheksidin çözüm) ve izopropil alkol kullanarak hazırlayın. Karın erişmek için göbeğini merkezli bir neşter bıçak kullanarak bir 8-10-cm ventral ensizyon olun. İnce bağırsak (değişir) yaklaşık 40 cm oral ileocecal kavşağı için tanımlayın. Çepeçevre bağırsak iki kez birleştirilmesi (ligasyon) tarafından 10 cm uzun döngüler değişir betimlemek, sonraki oluşturmadan önce her bağ arasında bir cm 10 cm (Şekil 1) sözlü olarak bulunan döngüler. Her zaman noktası iskemi iki döngü her diğer, iskemi diğeri iskemi için bitişik reperfüzyon bir ek 1 h ile isterseniz oluşturun. Tam iskemi (damar veya damarlar akımı) oluşturmak için kelepçe veya mezenterik damarlara bulldog vasküler kelepçeler, eğri Halstead sivrisinek hemostats veya 2-0 absorbe olmayan ipek 1, 2, 3 ve 4 h için kullanarak ligate ve kelepçeler 1 h için Kaldır reperfüzyon, isterseniz.Not: Yazarlar iskemi tüm döngüler ile 4 h iskemik döngü başlayarak sırayla oluşturulur ve proksimale (Toplam ameliyat süresini en aza indirmek için) taşıma ilerledi. İskemik barsak segmentleri komşu bitişik döngüler zarar verebilir olasılığını adrese, iskemik döngüler sırasını farklı olabilir. Bu toplam cerrahi zaman değiştirebilir.Not: Reperfüzyon zaman dilimi faiz ya da terapiler reperfüzyon dönemde test istiyorsanız araştırma sorusu dayalı çeşitli olabilir. Ancak, doku hasarı süreleri iskemi yalnız artan daha ağır hale geldikçe, reperfüzyon hasarı olasılığı daha fazla epitelyal yaralanma için katkı sağlamamaktadır. Reperfüzyon büyük olasılıkla iskemik yaralanma hafif dönemleri takip bir rol oynuyor. İskemi zaman puan arasında karın veya kapalı steril bir havlu ve/veya bir havlu kelepçe kullanarak kapalı tutun.Not: Bu deneme için tek bir hayvan içinde sekiz iskemik kesimleri oluşturulabilir. Bir ek jejunal segment, en az 5-10 cm bir iç normal denetimi olarak hizmet verecek son iskemik döngü, proksimal tanımlayın. Yaklaşık üç mezenterik gemi her bulldog damar kıskacı veya eğri Halstead sivrisinek hemostat engel. Çünkü damarları kolayca travma hemostat uygulama sırasında özen göstermelidir. Kelepçeler jaws içinde gemiler yığmak deneyin. Deney, Fentobarbital 85-100 mg/kg IV ile aşağıdaki ötenazi sonunda ölüm yok auscultated kalp atışı ve Korneal refleks kaybı ile onaylandıktan sonra metzenbaum makas, kullanarak doku tüm döngüler toplamak. Denetim biteviye-in normal değişir en az 5 – 10 cm son iskemik döngü için proksimal toplayarak başlatın. Ayrı ve döngüler her yaralanma zaman noktasından crypt yalıtım için hazır kadar buz gibi PBS küçük kaplarda saklayın.Not: arzu edilirse olun iskemik yeterince Histoloji ve bağırsak kök hücre kültür ayrı örnekleri bölmek için döngüler; Ancak, yazarlar döngüler yaklaşık 10 cm uzunluğunda büyük hemorajik olmak büyük olasılıkla olduğunu bulmuşlardır. 3. yeraltı türbesi (kök hücre) izolasyon iskemik ve denetim döngüler İnce bağırsak mukozal yüzeyinde ortaya çıkarmak için bir 20’lik tel ve doku forseps kullanarak her döngü tersine çevirin. Üst ve alt kısımlarında döngü için güvenli bir şekilde tel dikiş (2-0 absorbe olmayan ipek veya eşdeğeri) kullanarak bağlayın. İnversiyon, her döngü buz soğuk PBS luminal enkaz kaldırmak için durulayın. Örnekleri hemen DR #1 30 dakika buzda içeren 50 mL konik tüpler içine koyun. Denetim ile başlayan döngüler toplamak ve süreleri iskemi artırılan döngüler ile izleyin. Döngüler daha az hasarlı doku (yani kontrol ve 1 h iskemik doku) dan zorla, en iyi sonuç için kol dayama sarsılmış. Ağır hasarlı doku (3 ve 4 h iskemi) dokulardan yavaşça sarsan veya sadece çok fazla sallayarak crypt bozulma ve ek doku imha neden olur gibi ters gerekir. Tüpler sarsıldı veya buz ise her 5 dk ters. Örnekleri 10 min 37 ° C su banyosu için DR #2 aktarın. Sallamak ya da tüpler her 5 dk ters çevir. Dokular aktardıktan sonra DR #1 süpernatant EDTA kaldırmak için 2-4 h hasarlı döngüler içeren konik tüpler (5 min için 200 x g) santrifüj kapasitesi. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının zaten ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin. Örnekleri DR #2 kaldırın ve doku örnekleri doğrudan 25 mL soğuk PBS buz (etiket yıkama #1 olarak) yerleştirin. Örnekleri 60 rpm’de buzda bir orbital çalkalayıcı yerleştirin. Devam sallamak veya her tüpün 30 için ters çevir’i s her 2-5 dak. 2-4 h dan içeren DR #2 Konik tüpler dokular, spin aktardıktan sonra EDTA süpernatant (5 min için 200 x g) kaldırmak için döngüler zarar görmüş. Bu dokularda oldukça zarar görmüş gibi kriptalarının ayrışmış olmak mümkündür. Süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS (5 mL) küçük bir hacmi ile resuspend ve 3.9 adıma geçin. Yıkama # 1 (veya DR) 50 µL aliquot kaldırma crypt ayrışma derecesi ve enkaz miktarını denetlemek için. Bir yeni 50 mL konik tüp içine yerleştirin doku (yıkama #2, #3, vb) olduğu gibi kriptalarının en az enkaz ve villus ile izole olana 25 mL soğuk PBS ve shake ile dolu.Not: Sağlam kriptalarının ve en az enkaz ile temiz bir kısmını yalıtmak için hedeftir. Her ek yıkama ancak çok fazla sallayarak ikincil doku/hücre zarar görmesine neden başlayacak hücreleri temizler. Ayrıca, Eğer kriptalarının yıkama adım ve bir ayrılma reaktif adım kaplama en azından kirlenme ile en iyi sonuçları elde. Kalan dokuyu ve 50 mL konik boru 200 x g de süpernatant kaldırmak için 5 dakika santrifüj kapasitesi sonra crypt Pelet PBS (5 mL) küçük hacim içinde kalan resuspend. Ters bir mikroskop kullanarak, 50 µL aliquots kriptalarının/kesir sayısını belirlemek için her örneği inceleyin. Bu son matris patty boyutu olarak 50-100 kriptalarının/50 µL, hedeftir.Not: çok yoğun bir örneğiyse, istenen konsantrasyon ulaşılana kadar soğuk PBS eklemeye devam edin. Örnek çok seyreltik, istenen crypt verim ulaşmak ve ayarlamak için gerekli aliquots sayısını belirleyin. Aliquot uygun birimlerin microcentrifuge tüp içine kriptalarının (aliquot gözlemler tarafından saptanır). Örneğin, = 150 µL örnek 50 kriptalarının/50 µL sonra X 3 çoğaltır patty başına aliquot 50 µL varsa / microcentrifuge tüp. = 300 µL/tüp ise örnek sadece 25 kriptalarının/50 µL sonra 2 aliquots gerekli olan / patty X 3 çoğaltır. Pelet kriptalarının 200 x g 4° C’de 5 min için de Yavaşça pelleted kriptalarının uygun birim ana Mix (iyi başına 50 µL) ile resuspend. Hava kabarcıkları oluşturmadan, 15 kez pipetting hızla tarafından iyice karıştırın.Not: önceden ana mix aspirating önce soğuk steril PBS pipet ucuyla cool. Bu ana mix yayılan tutmak yardımcı olacaktır. İpuçları da buzdolabında muhafaza ve mahallede hemen kullanmak için önceden yerleştirilir. Bir 50 µL ana mix artı crypt damlacık her şey önceden ısıtılmış 24 iyi plaka merkezine dağıtmak. 37 ° C’de 30 dk kültür plaka kuluçkaya Her matris patty ile 500 µL / de medyanın IESC (hiçbir ek büyüme ana karışımı içinde yer alır gibi gün 0 gerekli faktörleri) yerleşimi. 500 µL steril PBS nem korumak için plaka üzerinde yaptı kullanılmayan herhangi bir kuyu ekleyin. Kaplama kriptalarının gün 0 saymak.Not: Ön ızgara her hücre kültür plaka kadranın daha doğru sayma sağlamak için yardımcı olur. Enterospheres her 24 saat sayısını ve her gün enteroid gelişimi için izleyebilirsiniz. Büyüme faktörleri her 48 de her h. için her 96 h IESC medyayı çıkarın ve 500 µL taze medya (büyüme faktörleri sonra medyaya eklenmelidir) yerine ekleyin.

Representative Results

Tam intestinal iskemi dikiş veya Şekil 1′ de gösterildiği gibi kelepçeler ile damar tıkanıklığı kullanarak küçük bağırsak döngüler içinde oluşturuldu. Kıskaç serbest bırakarak, reperfüzyon kontrollü bir süre, isterseniz sonraki reperfüzyon hasarı ek çalışma için izin gerçekleştirilebilir. Ötenazi kadar en az komplikasyon ile işlemi sırasında tüm hayvanlar hayatta. En sık kullanılan cerrahi komplikasyon hipotansiyon, dobutamin gibi pozitif inotrop takviyesi ile çözülmüş oldu. Doğru olarak gerçekleştirdiyseniz, iskemik yaralanma bağırsak villus ucunda başlar ve aşağı içinde crypt iskemi artar (Şekil 2) süresi olarak geçirilir. Kan damarları değil bakmaksızın veya eşit klempe cerrahi tekniği ile bir yaygın hata oluşabilir. Bir hemorajik iskemi (Şekil 3), hangi ek kan doku sızmak izin arter önce ince duvarlı ven çöker sonucudur. Bu ağır soluk bir yüzeye tam iskemi (Şekil 3, sağ) sırasında karşılaştırıldığında bir koyu mor serozal yüzey (Şekil 3, sol) olarak görülüyor. İskemik bağırsak döngüler kaldırılmasını, bağırsak kriptalarının ayrılma protokol (Şekil 4) sonrası başarılı bir şekilde izole edildi. Beklendiği gibi daha ağır hasarlı timepoints üzerinden kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. İletişim kuralı sırasında ağır yaralı bağırsak yavaşça alttaki dokulara ek zarar görmemesi için sarsılmış gerekir. Sallayarak çok kabaca daha fazla crypt hasar ve ek bozulma sonucu EDTA içeren DR çözümlerinde biten kriptalarının çoğunluğu neden olabilir. Kaplama, iskemi tüm zaman noktalarından kriptalarının hayatta kalmak ve Kültür (Şekil 5) kurulan haline edebiliyoruz. Ne zaman normal ve hafif hasarlı bağırsak kriptalarının kültür, enterospheres form içinde 24-48 h kaplama. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h), bağırsak kriptalarının hayatta ama, çok daha küçük küreler oluşumunda başlangıçta kaynaklanan hasar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. Genel olarak, azalan büyüme verimlilik kriptalarının yanı sıra ciddi bir şekilde zarar görmüş bağırsak dokusundan (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) elde edilen enteroids azalmış bir boyutu olduğunu. Resim 1 : Tam intestinal iskemi bir domuz modelinde cerrahi modeli. A) exteriorized normal domuz değişir. B) mezenterik damarları dikiş intestinal iskemi oluşturma tane. C) istenirse doku reperfüzyon için izin vermek için buldozer vasküler kelepçeler kullanılarak oluşturulan iskemi. D) bağırsak damarlara hemen ardından vasküler kelepçeler kaldırılması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : Tam intestinal iskemi uzun süreleri takip epitel zarar artan histolojik kanıt (Hematoksilen ve eozin (H & E) leke). Hasar villus ucu kademeli kaybı tek hücre epitel tabakası, i. blunting ve ciddi yaralanma (4 s süresi) ile temel crypt aşağı uzanan hücresel hasar ile başlar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Hemorajik iskemi brüt ve histolojik kanıtı. A) Brüt fotoğraf hemorajik iskemi (sol loop) ve tam iskemi (doğru döngü) karşılaştırma. Damarlara bakmaksızın değil veya eşit olarak sabitlenmiş, kan ek inflamasyon ve hasar sonucu dokular, sızmaya devam edebilirsiniz. B) H & E görüntüleri süresi 1-4 h artan hemorajik iskemi. Tam iskemi ile görülen hücresel hasar yanı sıra kırmızı kan hücre infiltrasyonu çevreleyen lamina propria içinde kanıt yoktur. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Bağırsak kriptalarının iskemik ve normal bağırsak döngüler izole aliquots. Eksiksiz, bozulmamış bağırsak kriptalarının (yıldızlar) başarıyla bağırsak her döngü izole edildi. Beklendiği gibi daha fazla ağır hasarlı zaman noktalarından kriptalarının kez kırık vardı (f; parçası) ve yeraltı türbesi kesirler bulunan bu Hayır uygulandı karşılaştırıldığında daha fazla arka plan hücresel enkaz veya hafif hasar. 100 µm ölçek çubuğu. Ben iskemi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : Zaman ders yalıtım ince bağırsak iskemik döngüler takip bağırsak kök hücre büyüme. Normal bağırsak kriptalarının kültüründe kaplama zaman içinde 24-48 h enterospheres kurdu. Ağır iskemik hasar (3 ve 4 h) ile kriptalarının hayatta ama çok daha küçük küreler başlangıçta oluştururlar. 72-120 h tarafından enteroids açık Merkezi lümen ve tomurcuklanma yapıları ile daha karmaşık hale gelir. 20 µm ölçek belirtilmediği sürece bar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Büyüme faktörü Eritici Hisse senedi toplama Hisse senedi seyreltme Çalışma seyreltme R-Spondin PBS 100 X 100 µg/ml 1 µg/ml Kafa SW/0.1%BSA 1000 X 100 µg/ml 100 ng/ml EGF 10mM asetik asit 10.000 X 500 µg/ml 50 ng/ml A-83-01 DMSO 1000 X 500 ΜM 500 nM SB202190 DMSO 3000 X 30 mM 10 ΜM Nikotinamid SW 1000 X 1 M 1 mM Gastrin PBS 10.000 X 100 ΜM 10 nM Y-27632 PBS 1000 X 10 mM 10 ΜM LY2157299 DMSO 10.000 X 5 mM 0,5 ΜM CHIR99021 PBS 1000 X 2.5 mM 2.5 ΜM Wnt3a PBS 2000 X 200 µg/ml 100 ng/ml Tablo 1: büyüme faktörü reaktif tablo. Büyüme faktörü hisse senedi çözümler ve bu protokol için kullanılan çalışma çözümleri Özeti.

Discussion

Domuz manken segmental intestinal iskemi gelişimini doku yaralanma aynı hayvan içinde birden fazla zaman puan incelenmesi için izin vererek önceki fare modelleri genişletir. Uygun damar ligasyonu, doku reperfüzyon ve başarılı crypt hücre kültürü de dahil olmak üzere bu protokol birkaç kritik tartışma noktaları vardır.

Uygun damar ligasyonu tam iskemi modeli oluşturulması esastır. Dikişi düzensiz bağlı veya kelepçe tamamen, kandan sıkılır değil kalın duvarlı arter doku girmeye devam edebilir ve ince duvarlı ven çöküşü nedeniyle çıkılamıyor. Bu kan ekstravazasyonu içine lamina propria ek doku hasarına neden olur. Ancak, iskemik yaralanma okudu türüne bağlı olarak, tam veya hemorajik iskemi istenen. Örneğin, bağırsak nakli sürecinde bağırsak tamamen tam intestinal iskemi sonuçları yordamı rezeksiyon aşamasında vasküler kaynağı (arter ve ven) ayrılır. Ne zaman bıçaklanmasından bir bağırsak volvulusu gibi bir olay sırasında bükülmüş, alternatif olarak, ancak, venöz dönüş kez önce arteryel kaynağı olmak önce doku içinde ek kan yol tıkalı, böylece yaratma engel hemorajik iskemi.

İskemik yaralanma villus ucunda başlayan ve mezar odası3Bankası aşağı uzanan doku hasarı sonuçlanır. İskemi sırasında enerji adenozin trifosfat şeklinde kullanılmak üzere devam ediyor ve metaboliti hypoxanthine oluşturur. Doku oksijen ile Reperfüze ne zaman, hypoxanthine ksantin oksidaz tarafından metabolize olur ve süperoksit serbest radikallerin mukozal hasar ve cazibe doku nötrofil17,18zarar yol üretir. Mukozal vasküler mimari aynı zamanda ksantin oksidaz, değişen ifade tür farklılıklar neden reperfüzyon hasarı3derecelerde. Kedi ve kemirgen iskemi-reperfüzyon reaktif oksijen metabolitleri19,20ila reperfüzyon hasarı için daha duyarlı modellerdir. Buna ek olarak, domuz daha az ksantin oksidaz ve bu model daha karşılaştırılabilir insan intestinal iskemi21yapmak bu nedenle daha az reperfüzyon hasarı için bulunamadı. Şu anda, nakavt veya bağırsak yaralanma çalışmaya transgenik domuz modelleri kullanımı, bu bu modelin büyük bir sınırlama yaparken tarif edilmiştir değil. Hastalık süreci uygun hayvan modeli seçimi bağlıdır veya belirli koşul araştırmacı çalışma istiyor. Örneğin, fare modellerinde en iskemik yordamlar 45-60 dk23ise maksimum 6 s iskemik yaralanma domuz modelleri açıklanan22, olmuştur.

Kültür epitel kurtarma çalışmaları için gelen normal ve ischemically zarar görmüş bağırsak bağırsak kriptalarının başarılı yalıtım sağlar. Bu sistem araştırmacı olarak değil damar kaynağı ya da göz önünde bulundurulacak bağışıklık hücre bileşeni benzersiz olarak tek başına, epitel odaklanmak izin verir. Bu epitel hücre etkileşimleri ve yaralanma yanı sıra farklı büyüme faktörleri veya cerrahi veya aşağıdaki crypt yalıtım sırasında kültür medya ilave tarafından yönetilen tedavi yanıtı aşağıdaki kurtarma çalışması için bir fırsat sunuyor. Bu adım en zor kalır, ağır hasarlı döngüler izolasyonu gerektirdiği kadar nazik sallayarak ve EDTA içeren çözümleri hızlı çıkarma kriptalarının gerekirse zamanından önce ayrışmış haline. Bu döngü bağırsak iyice yıkanır değil eğer kriptalarının kültüründe kontamine potansiyeline sahip. Sonuç olarak, antibiyotik antimycotic çözüm her iki DR çözümlerine ek olarak IESC medya için eklendi. Başka bir tartışma noktası normal bir denetimi toplanan bağırsak üzerinde duruluyor. Hayvanları anestezi ile inflamatuar aracılar iskemi için ikincil dolaşan olasılığı ile birlikte sistemik doku perfüzyon olası değişiklikler geçmesi gibi hatta “normal” Denetim doku gerçek kontrolü temsil etmeyebilir. Bu deneylerde, bu denetim doku doku için fena halde ve histolojik olarak karşılaştırılabilir iskemi (Gonzalez, L.M., yayınlanmamış veriler, 2017) diğer deneylerde geçmesi değil hayvanlardan çıktı notun var.

Özet olarak, bu yöntem bir tekrarlanabilir model yakından ne insan iskemik yaralanma oluşur modelleri domuz intestinal iskemi, açıklar. Ayrıca, iskemik döngüler bağırsak kök hücrelerden yalıtım anlatılan, hangi çalışma epitel onarım ve olası tepki kültür tedavi için hizmet vermektedir.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987 ve bölümü Klinik Bilimler yayma fon tarafından desteklenmiştir

Materials

Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free Fisher Scientific  BP-399 Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O) Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Scientific 20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED45 Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma Aldrich 646563
Y-27632 Sigma Aldrich Y0503
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634-010
N2 Supplement Life Technologies 17502-048
B-27 Supplement Life Technologies 12587-010
HEPES Life Technologies 15630-106
Glutamax Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B Gibco 15240-096 Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a R & D Systems 5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1 R & D Systems 4645- RS
Recombinant human Noggin R & D Systems 6057-NG
Recombinant human EGF R & D Systems 236-EG
LY2157299 SelleckChem 52230
CHIR99021 Cayman Chemical 13122
Human [leu]15-Gastrin 1 Sigma Aldrich G9145
SB202190 Sigma Aldrich 57067
A83-01 Tocris 2939
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Water, WFI Quality Corning, Inc. 25-055-CM Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153
Matrigel Matrix, GFR Corning, Inc. 356231 Phenol red free
24 Well Culture Dish Corning, Inc. 3524
Conical Tube, 50 ml  Corning, Inc. 430828
Scalpel Handle World Precision Instruments 500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 World Precision Instruments 504169
Tissue Forceps World Precision Instruments 15918
Debakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501239
Mayo Scissors World Precision Instruments 501752 Curved or straight
Metzenbaum Scissors World Precision Instruments 501739
Mosquito Forceps, Curved World Precision Instruments 503724-12 Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp Stoelting Co. 52120-40P Straight
Silk, 2-0  Henry Schein 685S-BUT Any similar brand is acceptable
Towel Clamps World Precision Instruments 501700
Needle Holder World Precision Instruments V503382
Wire suture, 20 gauge Henry Schein 19075 Cut and straighten before use.
Surgical Towels Henry Schein ST1833 Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution Henry Schein 9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%) Henry Schein VINV-CHMX-SCRB Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70% Henry Schein MS071HS Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge Henry Schein 2225PUR May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml) Henry Schein 33198
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 11695-6835-1 Controlled medication
Isoflurane solution Henry Schein 10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) Vortech Pharm. Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad  Gaymar Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor Mindray North America Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer  Vetland Medical Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump Abbott Hospira Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion–from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  2. Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
  3. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
  4. Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
  5. Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
  6. Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
  7. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  8. Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  11. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
  14. Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
  15. Swindle, M. M., Smith, A. C. . Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , (2015).
  16. Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. . Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , (1995).
  17. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
  18. Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
  19. Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
  20. Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
  21. Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
  22. Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
  23. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).

Tags

Intestinal Stem CellsIschemiaPorcine ModelSmall IntestineCrypt IsolationEpithelial Stem CellsDissociation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia. J. Vis. Exp. (135), e57647, doi:10.3791/57647 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image