פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

כתב יד זה מתאר הליך מעשית לצורך המחקר של זיכרון המערכת החיסונית האדם תגובות ויוו, באמצעות קציר האחזור של תאים אנטיגן עורית על ידי שאיבה שלפוחית אינדוקציה. הבטחה למחיר שימש דוגמה של אנטיגן intradermal התצהיר ואת האחזור חיסון ה-BCG. לבסוף, דוגמה של SB אפיון הדגימה על-ידי cytometric זרימה וניתוח ציטוקין מולטיפלקס היה בתנאי, הוכחת זה בערך שליש התאים SB היו אנטיגן ספציפי polyfunctional תאי-T של פנוטיפ זיכרון אפקטור.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים את טכניקת ההזרקה intradermal, אינדוקציה שלפוחית היניקה את הניקוב שלפוחית. ראשית, תצהיר intradermal נכונה דורשת צוות מיומן. התצהיר שגוי יכול להוביל לתוצאות שיוצרת. PPD בדרך כלל אנטיגן עורית ידועה ובטוחה, אך הקומפוזיציה שלה עשויים להשתנות בין היצרנים, הגבלת comparability^13,20. דוח זה מספק הנחיות תצהיר intradermal יחיד של 2 TU, ואת התצהירים במקביל שני אופציונלי (TU 2 x 2), אשר עשויים לחייב אישור אתיים נוספים. עם זאת, מחקרים אחרים השתמשו 10 TU, אשר מגבירים את הסבירות של העור חזק תגובה^10,21. במהלך השלב אינדוקציה SB, העלאות stepwise קטן הלחץ השלילי תפחית את הסיכון של דימום, שלפוחית קרע. הסיכויים של זיהום עם כדוריות דם אדומות או leucocytes מזרם הדם הם בדרך כלל נמוך². הטכניקה aseptic לנקב מניעת זיהום מיקרוביאלי, נמנע מקשר בין המחט לנקב את הרצפה שלפוחית עורי ומפחיתה זיהומים של פסולת או תאי העור תושב. עם זאת, יש חוקרים מעדיפים הקציר SB נוזל על-ידי החלת שלפוחית מנוקבת¹⁰לחץ מתגלגל. יתכן צורך לנקב את septa בתוך הכוויה. הטכניקה SB עצמה היא פולשנית; SBs התמוטט לרפא ללא צלקות, זיהומים הם נדירים מאוד. ² . אולם, מידה מסוימת של היפו פיגמנטציה עלולה להתרחש, SB אינדוקציה להימנע ככל הנראה אצל אנשים עם היסטוריה של הצטלקות קולואיד.

מגבלות טכניות התשואות בתא סכום נמוך וכוללים אפשרויות מוגבלות כתוצאה מכך לאחסון לטווח ארוך. קשרי הגומלין בין התשואה leucocyte, הבטחה למחיר לתגובות הקליניות, שלפוחית בגודל כדוריות דם אדומות זיהום כבר תיארה היטב במקום אחר^2,10. בניסויים BCG-החזרה המובאת כאן (איור 1), התשואה הכולל החציוני של כל שלפוחית היה 50,000, רומז מלכודת הניסוי בקנה מידה קטן באמצעות תאים אלה, במיוחד אם SBCs למד לבד¹⁵. עם זאת, האוכלוסייה תא T ספציפי דוגמה SB חורג בעיקר מה נמצא בדגימות PBMC ב נחשב תא יחסיים ומוחלטים. בדוגמה המוצג באיור2, מספר התאים טריפל-חיוביות PPD ספציפיים T-דגימה של תאים SB 100,000 היו יותר מ 2 x גדול מקו מספר שנמצא ב 1 x 10⁶ PBMCs אותו התורם (נתונים לא מוצג). הבקיע חזותי של התגובה הבטחה למחיר הוא השיטה הנפוצה ביותר קליני על ההערכה של זיכרון מ. שחפת . ראוי לציין, התגובה חיסונית אדפטיבית הבסיסית לא לשיא באותו זמן כמו עור קליני תגובה^2,21. לא כל ה-BCG-חוסנו או שחרור מהיר למוט אוכף-הנדבקים יפתחו תגובות הבטחה למחיר וחזק אסטרטגיות עבור סיווג וטיפול דגימות ללא הבטחה למחיר המגיבים, כמו גם רגישות עולה mycobacterial שישנו באוכלוסיית המחקר, צריך לקחת בחשבון לפני ביצוע ניסוי האחזור בשיטה זו. בנוסף, SB דגימה והן הבקיע חזותי, יש פוטנציאל דעה קדומה תיאורטי אצל אנשים עם תגובות העור מופחת עקב הכללית או הקשורות העור חסינות כפי שניתן לראות, למשל, הידבקות ב- HIV ו בקבוצות גיל מסוימות^{2, 13,18,20}. בנוסף, לחיזוק אימונולוגי התגובה הבטחה למחיר עם בדיקות חוזרות ונשנות הוא ידוע^20,22. עם זאת, הפנוטיפים תא SB להישאר קבוע למדי כאשר TSTs הם חוזרים ונשנים¹⁰. התבוננות זו תומכת את התפקיד של SB להיזכר במחקרים האורך של תגובות חיסוניות הסלולר.

עבור immunologists T-cell, SB האחזור מאפשר היבול של שברים גבוהה של תאים אנטיגן ספציפי. אולם, העיתוי של SB עבור דגימה מן תצהיר PPD חיוני כמו הרכב הסלולר והן את microenvironment ציטוקין להשתנות עם הזמן. ב פרוטוקול זה, שלפוחיות היו המושרה 7 ימים שלאחר אתגר והתאים מבודד היו בעיקר CD4 + אפקטור זיכרון תאי T-כולל שברים גבוהה של תאים עם ביטוי משותף של IFN-γ, TNF-α ו- il-2. תצפיות אלה עולים בקנה אחד עם מחקרים קודמים המתארת כיצד הפעלת T-cell, התפשטות, בידול מתרחש העור PPD-איפה זה מונח^2,15,21. קינטי SB אצל אנשים רגיש-PPD שסיקור זה התגובה העור מוקדם מאוד לא ספציפי; עם זאת, כבר בתוך הימים הראשונים שלאחר PPD-האתגר, התגובה הופך להיות נשלט על ידי CD4 + T תאים (שני פנוטיפים הזיכרון המרכזי של זיכרון ו אפקטור שהיית המתוארת), לאחר 3 ימים, התגובה נשלטת על ידי שברים גבוה של ציטוקין PPD ספציפיים בייצור תאי CD4 + T^2,8,10,15,21. תגובה זו ציטוקין מסתגלת נשאר גלוי, לגלוי עבור יותר מ 2 שבועות^2,8,10,23. יום 7 פוסט-הבטחה למחיר נראה נקודת הזמן האופטימלי ביותר של האוסף של ציטוקין לייצר תאי-T זיכרון CD4 +². עם זאת, נקודות זמן אחרות, כמובן, ייתכן הרלוונטי בהתאם אנטיגן התגובה של עניין. ראוי לציין, במחקר אחד, התגובה PPD מסתגלת דווח שיאי קצת יותר מוקדם עם ירידה הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים כבר בגיל 5 ימים פוסט-הבטחה למחיר¹⁰.

SB נוזל מכיל רמות גבוהות של ציטוקינים פרו-דלקתיים והן לחלבונים אחרים הוכח להיות נציג של העור microenvironment^15,24. קינטיקה מחקרים הראו כי TNF-α ו- IFN-γ רמות שיא נוזלים SB לאחר 3 ימים בזמן il-2 רמות שיא לאחר 7 ימים^2,10, כנראה המשקף את הדומיננטיות של תגובות מסתגלת בשלב מאוחר יותר. כי תאים SB היה מופעל ויוו, שהם מייצגים את שחרור ציטוקינים ספונטנית גבוהה, כמו גם אפשרות של שחרור מסוים על לרסטימולציה (איור 3 ו- 4).

דו ח זה מתמקד CD4 + T-cell חסינות. כפי שהוכח באיור2, הרוב המכריע של תאי-T מבודד היו אכן CD4 +, אף שלא היו כמעט אין CD8 + תאי-T בהיניקה שיהיו שלפוחיות נוזל. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים אחרים SB PPD-החזרה דיווח על הפרופורציות נמוך קיבולת נודדות נחות של CD8 + T תאים בהשוואה CD4 + T תאים^2,8,10,23. אפיון נוסף של התרומה CD8 + עדיף; עם זאת, זה מעבר להיקף של דו ח זה.

תאי-T נחשבים חיוניים עבור הפקד המערכת החיסונית של Mtb; עם זאת, מתקשים לזהות לתאם אמין של ההגנה משתקפת תגובה חיסונית אדפטיבית מ^25,דם²⁶. המחסום הזה קשות מעכבת את התפתחות חיסונים טרה-בתים חדשים, כמו שיש כיום אין אלטרנטיבה גדולות ויקרות מאוד יעילות בניסויים²⁷. מפתחים חיסון נגד שחפת לקבוע immunogenicity חיסון על ידי הערכת שינויים קטנים וחולף על האוכלוסיות T-cell חיסון ספציפיים^28,הדם²⁹. אולם, זה בספק אם השבר קטן של מחזורי T אנטיגן ספציפי-נמצאו בדם תאים רלוונטי (כלומר, יכולת המעבר לאתר של זיהום ושל נציג השליטה microenvironment T-תא-עשיר שחרור מהיר למוט אוכף) ^{27 , 30 , 31} .

בהתבסס על מחקרים קודמים, הנתונים המוצגים במסמך זה, המודל האחזור עורית SB מייצג פוטנציאל לא ממומש לחקר תאי-T החיסון הספציפי. לא רק הדגם מאפשרת החזרה של החיסון התגובה שנוצר לפני עשרות שנים, הוא גם מאפשר את ההערכה של הזיכרון האמיתי פוטנציאלית רקמות ספציפיות בהקשר^15,18,19,21. הרומן, בדיקות עור ספציפי, אשר כוללים אנטיגנים גם מורכבת של המועמד חיסונים טרה-בתים, מציע הזדמנויות חדשות להערכת החיסון באמצעות^28,זה דגם³². יתר על כן, ניתוח transcriptomic מציע כי התא – mediated החיסון לתגובה שנוצר בעור תיגר PPD דומה על התגובה שנמצאו על שחרור מהיר למוט אוכף-נגוע ריאות¹⁸.

בזמן ביופסיות ניקוב העור גם לאפשר לקציר תא מן העור ולספק מידע מרחבי, לעומת דגימה SB, השיטה הוא פולשניים יותר ודורש עיבוד אנזימטי או מכונאי להכין תא בודד המתלים³³. מדידות של ציטוקינים והתא סמנים דומים בין שתי שיטות ה-^2,10.

שיטת השאיבה שלפוחית כבר הוחל בתחומים רבים של מחקר רפואי חוץ דרמטולוגיה, לבד או בשילוב עם אתגר עור מערכתית או מקומיים. דוגמאות כוללות לימודי של אלח דם, lymphoproliferative וירוס אפשטיין בר-הקשורים למחלה, נוירופתיה סוכרתית, אפקטים צריכת glucocorticoid בניסויים בבני אדם, בדיקות נוגדנים טיפולית או מודלים עבור טיפולים T-תא-ממוקד^{10 ,34,35,36,37,38}.

מנקודת מבט טיפולית, השיטה האחזור עורית SB מציע יתרונות ייחודיים ללמוד את הזיכרון T-cell מרכזי פוטנציאלי ומ שני ביולוגית וטכני מנקודת מבט-לעור נראה לספק תא הדגימה רלוונטי^{2, 15,18,19,21}. בפרט, לעומת דגימה מסורתי, פסיבי של מחזורי PBMCs, שיטת האחזור עורית SB מאפשרת לחקר תאי-T אשר הוכיחו את היכולת להעביר מן הצומת לימפה בתגובה אנטיגן הרלוונטיות שלהם, ולהשלים המקומי הרחבת ובידול רקמות ספציפיות ויוו ההקשר^15,18,19,21.

לסיכום, המודל הפגינו כאן יכול להיות רלוונטי עבור חוקרים בתחום האנושי חסינות מסתגלת וסוכנים T-cell מיקוד (קרי, במחקר vaccinology או סרטן מחלות זיהומיות). המודל הבטחה למחיר יושמו פרוטוקול זה הוא, כמובן, רלוונטי בתחום של vaccinology טרה-בתים. אולם, התפיסה הבסיסית של מודל זה הוא מאוד רלוונטי בתחומים אחרים של מחקר.