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Inmunología y contagio

Un protocole de boursouflure d’aspiration pour étudier les cellules T humaines rappel Responses In Vivo

Published: August 11, 2018
doi:
10.3791/57554
, , , , , ,
1Department of Infectious Disease Immunology, Center for Vaccine Research,Statens Serum Institut, 2Department of Infectious Diseases,Hvidovre Hospital, 3Institute of Clinical Medicine, Faculty of Health and Medical Sciences,University of Copenhagen, 4Division of Infection and Immunity,University College London

Summary

Ici, nous fournissons une démonstration du modèle rappel cutanée vésiculeuse d’aspiration. Le modèle permet un accès simple étudier les humains in vivo les réponses immunitaires adaptatives, par exemple dans le cadre du développement de vaccins.

Abstract

Cutanée antigène-Rappel modèles permettent pour l’étude de la mémoire humaine responses in vivo. Lorsqu’il est combiné avec l’induction de peau boursouflure d’aspiration (SB), ce modèle offre l’accessibilité aux rares populations de représentant de lymphocytes T spécifiques de l’antigène de la réponse de la mémoire cellulaire ainsi que la cytokine microenvironnement in situ.

Ce rapport décrit la procédure pratique de rappel cutané, une induction de SB et une récolte des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. Pour illustrer la méthode, test cutané à la tuberculine est utilisé pour le rappel antigénique chez les individus qui, avant cette étude, a subi un vaccin bacille Calmette-Guérin contre une infection par Mycobacterium tuberculosis. Enfin, exemples d’analyse de cytométrie de flux multiplex et flux des spécimens de SB sont fournies, illustrant les fractions hautes de polyfonctionnels spécifiques de l’antigène CD4 + T-cellules disponibles par cette méthode d’échantillonnage par rapport aux cellules isolées du sang.

La méthode décrite ici est sûr et peu invasive, offre une occasion unique d’étudier les réponses immunitaires innée et adaptative in vivoet peut être bénéfique à une large communauté de chercheurs travaillant avec l’homme et l’immunité à médiation cellulaire réponses de mémoire, dans le cadre du développement de vaccins.

Introduction

Un peau SB est une boursouflure artificiellement induite, qui permet pour la récolte des cellules et liquide directement à partir de la peau. La technique d’élevage SBs sous vide est un outil bien connu dans le domaine de la dermatologie utilisée pour l’étude de l’immunologie de la peau en santé et la maladie1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. le présent rapport illustre comment la technique de SB combinée avec rappel antigénique cutanée (méthode de rappel cutanée SB) peut fournir un aperçu direct des réponses immunes adaptatives in vivo.

Le principe de l’induction de SB est simple : une légère dépression est appliquée à une petite zone de la peau. La pression négative forcera éventuellement l’épiderme pour séparer le derme, créant une “ampoule” locale remplie de liquide et les cellules1,2,9. Le fluide boursouflure peut être récolté par une ponction à l’aiguille fine et le contenu peut être utilisé pour plus amples études in vitro.

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour la méthode SB pour l’étude de la réponse immunitaire en vivo autres que les maladies limités à la peau10,11. L’étude de l’immunité adaptative chez les humains est limitée par le fait que les cellules et les cytokines d’intérêt sont échantillonnées à partir du sang périphérique parce qu’un échantillonnage envahissant du ganglion lymphatique ou muqueuse gastro-intestinale peut être inacceptable et contraire à l’éthique. Un exemple est l’étude des réponses de longue durée de vie de la mémoire humaine lymphocytes après vaccination12. Dans ces essais, l’échantillonnage des lymphocytes T pertinents peut être un grand défi, car la population concernée de cellules qui assurent la médiation immunité réside dans le tissu lymphoïde, et qu’un nombre très limité de cellules T spécifiques circule dans le sang périphérique.

La technique de SB offre une occasion unique pour l’étude des lymphocytes T mémoires et autres populations de cellules spécifiques. Suite à l’inoculation cutanée de l’antigène, lymphocytes T spécifiques de l’antigène sont recrutés dans leurs cachettes lymphoïdes de la peau et peut facilement être dégustée de la SB. Les applications de méthodologie et de la recherche de ce modèle de rappel cutanées ont été décrites par Akbar et al. en 2013,2. Un antigène couramment utilisé pour le rappel de la peau est le dérivé protéique purifié commercialement disponibles (PPD) de mycobactéries utilisés pour effectuer un test cutané (TCT) de tuberculine13, où le PPD est injecté dans la couche cutanée de la peau. Chez les personnes ayant une mémoire immunologique existante vers PPD [par exemple, les personnes ayant une infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ou une vaccination préalable de bacille de Calmette-Guérin (BCG)], la déposition de l’antigène entraîne une rappeler la réponse avec la migration de la peau et une expansion clonale in vivo des cellules CD4 + T-PPD spécifique2,11,14,15. En conséquence, fractions hautes de PPD spécifique polyfonctionnels CD4 + T-cellules s’accumulent dans la peau prête pour l’échantillonnage de SB. T-cellules prélevés par cette méthode sont avérés robustes et sont suffisamment abondantes pour être caractérisée par un éventail de tests immunologiques et un à long terme in vitro culture15. Ainsi, le modèle de rappel cutanée et l’induction de SB peuvent s’avérer une méthode utile pour l’étude in vivo lymphocytes réponses par ex vivo des analyses et une meilleure connaissance de cette approche peut-être bénéficier des chercheurs ayant des intérêts dans l’immunologie cellulaire et vaccinologie.

Ce rapport présente le premier guide par étapes sur la façon d’induire des cloques d’aspiration de la peau humaine dans peau injection PPD. Le modèle de rappel des antigènes cutanés est démontré à l’aide du TCT chez les volontaires vaccinés par le BCG. Enfin, l’analyse pertinente ex vivo des cellules et des cytokines isolé par SB est illustré. Les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules T spécifiques PPD obtenus par la méthode SB sont minutieusement décrits ailleurs2,10,11,16,17, 18 , 19. ce rapport vise à discuter des aspects pratiques et immunologiques de la méthodologie pour faciliter l’application de cette technique par d’autres groupes de recherche.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ci-dessous, y compris l’utilisation de volontaires humains, ont été approuvés par le Comité danois santé éthique de la recherche (H-15002988) et l’Agence danoise de Protection des données (jr.nr. 2015-57-0102). PPD doit être un produit certifié approuvé pour usage humain et administré dans le dosage correct fourni par le fabricant. Toute déviation de la posologie ou l’administration peut exiger des autorisations éthiques supplémentaires et bénévoles doivent donner leur consentement éclairé. 1. Test cutané à la tuberculine Obtenir le consentement éclairé oral et écrit de volontaires. Avant l’injection, s’assurer que le bénévole comprend et accepte la procédure, y compris les effets indésirables possibles.Remarque : Les critères d’Inclusion spécifiques au présent protocole sont âge > 18 ans et une vaccination par le BCG documentée. Critères d’inclusion peuvent varier en fonction de la question de la recherche (c.-à-d., un critère d’inclusion supplémentaire pourrait être une preuve de TCT positif). Utilisez une solution toute faite de PPD à usage humain [20 tuberculine unités (TU) / ml]. Désinfecter le bouchon d’un flacon à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Préparer le site d’injection Localiser le point d’injection sur la face ventrale de l’avant-bras du bénévole. Placez le bras palm-up sur une surface plate et choisissez une zone sur le tiers supérieur de l’avant-bras, environ 5-10 cm de l’articulation du coude. Tenez-vous à l’écart des cicatrices, veines ou la peau endommagée. Désinfecter la zone à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Préparer la solution PPD Utiliser une seringue 1 mL stérile avec un 27-30G/court (p. ex., 12 mm) fixé l’aiguille. Doucement, mélanger et aspire 0,1 mL de la solution PPD. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles visibles. Injection intradermique de PPDRemarque : Cette étape explique comment effectuer un dépôt unique de PPD, mais plusieurs dépôts de PPD dans le même bras est possible. Toutefois, cela peut nécessiter une approbation éthique spécifique. La peau est tendue et pointer l’aiguille à un angle de 5-15° la peau avec le biseau vers le haut. Insérez l’extrémité de l’aiguille dans la couche cutanée de la peau et assurez-vous que l’embout est presque visible à travers l’épiderme. Injecter lentement 0,1 mL de solution PPD.Remarque : S’il est administré correctement, une papule pâle de 6-10 mm apparaîtra immédiatement. La papule disparaît après environ 10 min. Lorsque vous effectuez deux ou plusieurs dépositions, viser une séparation maximale (5-10 cm) les sites d’injection tout en gardant une bonne distance de la zone du coude et du poignet.NOTE : Cela empêche une confluence potentielle de la réponse du test cutané et permet le positionnement ininterrompu de deux chambres d’aspiration. 2. évaluation de la réaction de la peau – jour 3 Après 48 à 72 heures, notez la taille de la réaction de la peau. Mesurer l’induration (l’enflure) et pas l’érythème (la rougeur) de la réaction. Palper le dur gonflement à l’aide des doigts, puis marquez les bords de l’induration à l’aide d’un stylo à bille. Utilisez une règle pour mesurer le diamètre de l’induration et noter le résultat en mm.Remarque : Une lecture de la taille de l’induration peut guider le choix du diamètre de l’orifice pour la chambre d’aspiration. 3. d’aspiration Blister Induction – jour 7 Assembler le dispositif d’aspiration.Note : Unités de dispositif d’aspiration sont des pompes à vide avec chambres ci-joint pour l’induction de boursouflure d’aspiration. Le dispositif utilisé dans cette démonstration est faite sur mesure, mais les unités de dispositif d’aspiration sont également disponibles dans le commerce. La pompe doit être réglable dans la plage de -20 à-40 kPa et de fournir une pression négative stable et fiable. Approbation éthique régionale devrait être obtenue avant d’effectuer des expériences à l’aide de cette méthode. Tout d’abord, préparer la chambre d’aspiration par l’assemblage de la plaque à orifice inférieur et la plaque de la fenêtre avec la chambre et le tuyau de raccordement. Serrer le tuyau de raccordement à la chambre de la pompe à vide.Remarque : Les chambres devraient inclure une plaque de fond avec un trou pour l’induction de la boursouflure, qui devrait être adapté pour le contact avec la peau humaine, et d’un plateau supérieur avec une fenêtre, permettant le contrôle visuel de la cloque. Déterminer le diamètre d’orifice optimale de la plaque à orifice par rapport à la taille de la réaction de la peau ; plus la taille de l’orifice, plus la boursouflure. Désinfecter le diaphragme et la peau des volontaires à l’aide de tampons d’alcool. La chambre d’aspiration s’attacher à la peau. Assurez-vous que les bras des bénévoles se repose confortablement. Assurez-vous que le trou dans le fond de la chambre d’aspiration se trouve sur la réaction de PPD afin que le centre de la réaction de la peau soit visible. Sécuriser la chambre sans serrer à l’aide de sangles : lorsqu’on applique une pression négative, la Chambre va adhérer à la peau et maintenir sa position. Allumez le dispositif d’aspiration et régler la pression à-20 kPa. Après 30 min, augmenter la pression négative à-25 kPa. Après 60 min, accroître encore la pression négative à-30 kPa. Maintenir la pression à-30 kPa jusqu’à ce qu’une “ampoule” est complètement formée. S’assurer que les pressions négatives prévues dans le présent protocole sont spécifiques à un instrument sur mesure. Il peut être nécessaire d’ajuster la pression légèrement lors de l’application du protocole dans d’autres contextes.Remarque : La phase d’induction de boursouflure varie de 60 à 180 minutes (1-3 h) avec la formation de boursouflure réels survenant dans les derniers 30 min. cloquage est souvent associée à une sensation de picotement. Les cloques peuvent survenir comme des vésicules qui fusionnent simples ou multiples. Si rupture de boursouflure ou l’hémorragie se produit, il est conseillé de mettre fin à l’induction de boursouflure en relâchant lentement la pression. Une fois le blister est entièrement formé, relâcher la pression et retirer soigneusement la chambre d’aspiration de la peau sans rupture de la coque. Appliquer un pansement doux sur la zone de la peau environnante et placez un bouchon dur (par exemple, d’un tube en plastique de 50 mL) sur le blister. Fermer le capuchon avec ruban chirurgical non allergènes, suivie d’un bandage élastique doux. Instruire le volontaire pour éviter un effort physique excessif sur la zone de boursouflure pendant la prochaine 12 à 24 heures. 4. récolte du Blister liquide – jour 8 Le 8ème jour, délicatement retirer le pansement protecteur et désinfecter la cloque avec un spray de désinfection de la peau. Utiliser une seringue stérile de 2 mL avec une aiguille de 23G pour récolter le contenu de boursouflure. Introduire l’aiguille dans le côté haut/latérale sur le toit de la boursouflure et aspirer lentement le liquide. Évitez de toucher le fond de la cavité, mais n’oubliez pas de récolter tout le liquide. Appliquer un pansement sur le blister s’est effondré. Transférer le liquide de boursouflure dans un tube stérile. Noter le volume. Faites tourner le fluide boursouflure vers le bas à 600 x g, en utilisant une centrifugeuse sur table pendant 4 min. Transférer le surnageant dans un autre tube et Resuspendre le culot dans 500 µL de milieu cellulaire.NOTE : Les cellules sont maintenant prêts pour dépouillement et analyse. Surnageants peuvent être conservés à -20 à-80 ° C jusqu’à l’utilisation. 5. analyses de succion Blister de cellules et les fluides NOTE : Fourniture d’instructions détaillées pour l’analyse des cellules et le liquide de vésicules d’aspiration de la peau n’est pas dans le champ d’application du présent protocole. Toutefois, pour obtenir des résultats représentatifs pour ce rapport, tache intracellulaire écoulement cytometry et multiplex analyses ont été effectuées. La méthodologie est décrit brièvement ci-dessous. Cytométrie en flux Stimuler des suspensions de cellules fraîches de 1 x 105 isolées de cloques d’aspiration de 1 volontaire vaccinés par le BCG avec 10 µg/mL de PPD et incuber les cellules à 37 ° C et 5 % CO2. Inclure des cellules non stimulées pour une incubation parallèle. Stimuler les suspensions 1 x 106 PBMC obtenues de 1 volontaire vaccinés par le BCG avec 10 µg/mL de PPD et incuber le mélange à 37 ° C et 5 % CO2. Inclure des cellules non stimulées pour une incubation parallèle. Après 2 h, traiter toutes les cellules avec Brefaldin A et monensine et les incuber pendant 6 h à 37° C. Colorer les cellules avec un panel de Live/Dead-tache-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 et anti-IL-2-FITC. Inclure des contrôles de la FMO dans le panneau PBMC. Effectuer une analyse de cytométrie en flux avec un cytomètre en flux et analyser les résultats à l’aide du logiciel concerné. Porte sur la production de cytokine CD3 + CD4 + CD8-sous-ensembles à l’aide de la stratégie de blocage suivante : maillots – > viable CD3 + – > CD4 + CD8 – – > IFN-γ +, TNF-α + ou IL-2 +. Porte sur les populations de cellules effectrices mémoire à l’aide de la stratégie de blocage suivante : maillots – > viable CD3 + – > CD4 + CD8 – – > CCR7 – CD45RA-. Calculer les profils de cytokine individuels à l’aide de gating booléenne. Démonstrations de libération de cytokines Pour une démonstration d’une cytokine release in vivo, une analyse multiplexe permet de quantifier les niveaux d’il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 et IL-13 dans le liquide décongelés boursouflure d’aspiration de 4 volontaires. Pour une démonstration d’une libération de cytokines par les cellules obtenues de succion ampoules ex vivo, utilisation des cellules fraîches boursouflure d’aspiration puis PBMC extraite de 1 volontaire vaccinés par le BCG. Infecter le PBMC et cellules blister avec 100 unités formant colonie (UFC) de Mtb H37Rv d’aspiration et les incuber pendant 4 jours. Une analyse multiplexe permet de quantifier les niveaux d’il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 et IL-13 dans les surnageants de culture. Ajuster les mesures au-dessus de la plage de calcul de dosage jusqu’à la limite supérieure de calcul.

Representative Results

Huit volontaires adultes sains (âge médian : 30 ans, plage : 26-43 ans) à un documentés de la vaccination BCG précédent (délai médian de vaccination par le BCG : 5,5 ans, plage : 1-30 ans) ont été inclus. Les participants ont été contestées par voie intradermique avec 2 TU du PPD, suivie d’une évaluation de TST le jour 3. SBs ont été induites sur jour 7 et récoltés le jour 8, et toutes les ampoules ont été soulevées à l’aide de chambres de boursouflure d’aspiration diamètre orifice de 10 mm. Sept personnes ont reçu 2 vaccins séparés de PPD simultanément dans le même bras, suivi de 2 inductions de SB parallèles (veuillez vous reporter à la note au sujet de plusieurs dépôts de PPD étape 1.4 dans le protocoleci-dessous). Sang périphérique a été dessiné le jour 7 de plasma et d’un isolement de PBMC par centrifugation en gradient de densité. Plasma et le liquide surnageant de SBs ont été conservés à-20 ° C. Des cellules fraîches de SB (SBCs) ont été dénombrées à l’aide de la microscopie et coloration de nigrosine. Les réponses cliniques de TCT et le rendement de la SBC sont présentés dans la Figure 1. La taille médiane des indurations TST était 10,25 mm (gamme : 0 – 20 mm) et cellule médiane par blister, on comptait 50 000 (fourchette : 15 000-210 000 cellules, nombre d’ampoules : 15). Deux des volontaires n’avaient aucune réponse clinique ou l’autre des 2 TCT et un rendement faible total cellule correspondante de 15 000 cellules/blister. Le rendement de la cellule a été associé à la réponse clinique moyenne de TST (Spearman r = 0,643, p = 0,094). Figure 1 : Rendement cellulaire de succion boursouflure. (a) ce panneau montre un représentant microscopie des cellules isolées de SBs nigrosine déclenché 7 jours post-TST. (b) ce panneau montre les relations entre l’induration de TST moyenne (mm) et le rendement cellulaire moyen (nblister) dans 8 volontaires vaccinés par le BCG (nombre d’ampoules = 15). Les points représentent les mesures moyennes individuelles. Veuillez noter que les 2 points sont chevauchent comme 2 volontaires les deux eu une induration TST de 0 mm et un rendement de la cellule de 15 000. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Pour démontrer la caractérisation de cytométrie de flux SB de flux, SBCs proviennent d’un bénévole âgé de 43 ans qui avait été vaccinés par le BCG 30 ans plus tôt et n’avait aucune exposition connue à Mtb. The SBCs ont été isolés après l’induction d’un blister individuel ( Induration : 1,4 mm/100 000 SBCs). La figure 2 montre les emplacements représentatifs de la coloration de cytokine intracellulaire de la SBCs versus PBMC. Ce bénévole, la fraction du CD3 + CD4 + CD8-SBCs est passé de 67 % dans les cellules non stimulées à > 90 % à une PPD dans vitro restimulation, tandis que la fraction du CD3 + CD4 + CD8-PBMC est demeurée constante (~ 51 %, Figure 2). Plus de 92 % de l’ in vitro PPD-, ainsi que les CD3 + CD4 + CD8-SBCs non stimulées, étaient du type mémoire effecteur (CCR7 – CD45RA-, données non présentées). Les fractions globales des cellules CD3 + CD4 + CD8 spécifiques induites par la stimulation de la PPD étaient plus élevées dans les SBCs contre les PBMC (33,1 vs. 0,2 %, les échantillons non stimulées soustraits). Dans les PBMC, les fractions de polyfonctionnels PPD spécifique des cellules CD3 + CD4 + CD8 sont tous < 0,05 %. Figure 2 : Parcelles de cytométrie en flux représentatif de SBCs par rapport à PBMC. Panneaux a et b Voir la densité représentante parcelles des populations CD8 + et CD4 + (a) non stimulés vs. Stimulée par le PPD PBMC (c) SBCs. panneaux b et d lent des parcelles de cytokine intracellulaire de coloration au CD3 + CD4 + CD8-cellules stimulées par PPD pour (b) PBMC et (d) SBCs. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une plus grande version de ce chiffre. Comme prévu, CD3 + CD4 + CD8-SBCs étaient activées in vivo, illustrée par une forte proportion des cellules coloration pour surexprimés cytokines (12 %), avec les cytokines prédominants en TNF-α et IFN-γ. Toutefois, lors de la PPD-stimulation, la cytokine cellules sécrétrices transféré vers une triple ou double-positifs TNF-α, IFN-γ + IL-2 + (17 %) et IFN-γ + TNF-α + (15 %) profil (Figure 3 b, profils PBMC provenant du même donneur sont inclus à titre de comparaison, en Figure 3 a). Les profils d’expression de cytokines pour des sous-ensembles de T-cellules effectrices stimulée par le PPD memory CD4 + (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 – CD45RA-) étaient comparables à la CD3 + CD4 + CD8-population présentée dans les Figures 2 et 3 (données non présentées). Figure 3: profils de Cytokine pour SBCs non stimulées et stimulée par le PPD CD4 + versus PBMC.  Ces panneaux montrent des profils individuels de production de cytokine (un) CD3 + CD4 + CD8-PBMC cellules et (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Les barres représentent des fractions, des profils de cytokines spécifiques de l’antigène dans les cellules non stimulées (barres blanches) et lors d’une stimulation in vitro avec PPD (barres de couleur). Pour explorer le fluide SB comme une source d’information sur le microenvironnement de la cytokine sur le site de l’essai de la peau, les niveaux de cytokine ont été mesurées dans le liquide récolté de SBs induit 7 jours post-TST (Figure 4 a). Les concentrations médianes d’IFN-γ, TNF-α et IL-2 étaient 339 pg/mL, 19 pg/mL et 1 pg/mL, respectivement (n = 6). Les concentrations plasmatiques ont été généralement très faibles. Les cellules isolées de SBs produisent des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires ex vivo (Figure 4 b). Titrages des SBCs de 1 volontaire ont été cultivés pendant 4 jours en présence de virulentes M. tuberculosis ± PBMC autologue. Les niveaux d’IFN-γ étaient > 30 fois plus élevée chez les cultures contenant SBCs, indépendamment de la présence de PBMC. Figure 4 : Niveaux de Cytokine dans le liquide de SB, plasma, et MTB -infecté surnageants. (a) ce panneau montre des niveaux de cytokine dans le plasma et les liquides surnageants SB de 6 volontaires vaccinés par le BCG. Les barres représentent les niveaux de cytokine médian ; les barres d’erreur représentent la plage. (b) ce panneau montre les niveaux de cytokines dans les surnageants de 4 600 µl ex vivo 4 jours cultures parallèles de 1 x 106 PBMC (barres noires), 1,75 x 105 SBCs (barres blanches) et 1 x 106 PBMC additionné de 0,5 ou 1,75 x 10 5 SBCs (barres grises) infectés par m. tuberculosis. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cet article décrit une procédure pratique pour l’étude de la mémoire immunitaire humaine responses in vivo, à l’aide de récolte de rappel et les cellules cutanées antigène par induction de boursouflure d’aspiration. TST a été utilisé comme un exemple de dépôt antigène intradermique et rappel de vaccin BCG. Enfin, un exemple de caractérisation de spécimen de SB par analyse en flux par cytométrie en flux et multiplex cytokine a été fourni, démontrant qu’environ un tiers des cellules SB étaient spécifiques à l’antigène polyfonctionnels T-cellules du phénotype mémoire effecteur.

Les étapes critiques du présent protocole comprennent la technique d’injection intradermique, l’induction de boursouflure d’aspiration et la ponction de boursouflure. Tout d’abord, une déposition intradermique correcte nécessite du personnel qualifié. Un dépôt erroné peut conduire à des résultats sous-optimaux. PPD est généralement un antigène cutané bien connu et sans danger, mais sa composition peut varier entre fabricants, limitant la comparabilité13,20. Ce rapport fournit des instructions pour un seul dépôt intradermique de 2 TU et éventuellement deux dépositions parallèles (TU de 2 x 2), qui peuvent nécessiter une approbation éthique supplémentaire. Toutefois, d’autres études ont utilisé 10 TU, qui augmentent la probabilité d’une réaction de peau forte10,21. Durant l’étape d’induction de SB, petites augmentations progressive de la pression négative permettra de réduire le risque de rupture de l’hémorragie et blister. Les chances de contamination par les globules rouges ou de leucocytes du sang sont généralement faible2. La technique de ponction aseptique empêche la contamination microbienne et en évitant tout contact entre l’aiguille de ponction et le sol de boursouflure cutanée réduit les impuretés de débris ou de cellules résidentes de la peau. Toutefois, certains chercheurs préfèrent récolter le liquide SB en appliquant une pression de roulement à la boursouflure perforé10. Il peut être nécessaire de percer le septum dans le blister. La technique de SB elle-même est minimalement invasive ; SBs s’est effondrés guérissent sans laisser de cicatrices et les infections sont très rares. 2 Toutefois, une certaine hypo pigmentation peut-être survenir et induction SB devrait probablement être évitée chez les personnes ayant des antécédents de cicatrices colloïde.

Limitations techniques comprennent les rendements faibles cellulaires totales et par conséquent peu d’options pour le stockage à long terme. Les relations entre le rendement de leucocyte, les réponses cliniques de TST, le blister taille et contamination érythrocytaire a été minutieusement décrit ailleurs2,10. Dans les expériences de BCG-rappel présentés ici (Figure 1), le rendement total médian de chaque blister a 50 000, ce qui implique un montage expérimental à petite échelle à l’aide de ces cellules, surtout si SBCs sont étudiés seulement15. Cependant, la population de lymphocytes T spécifique dans un échantillon de SB pour la plupart dépasse ce qui est trouvé dans des échantillons de PBMC dans les deux chefs de cellule relative et absolue. Dans l’exemple présenté dans la Figure 2, le nombre de séropositifs au triple PPD-cellules T spécifiques dans un échantillon de 100 000 cellules SB ont été plus de 2 x plus grand que le numéro trouvé dans 1 x 106 PBMC auprès du même donneur (données non présentées). Un visuel marquant de la réaction de TST est la méthode la plus courante clinique pour l’évaluation du mémoire de M. tuberculosis . À noter, la réaction immunologique adaptative sous-jacent ne pas pointe en même temps que la clinique peau réaction2,21. Pas tous vaccinés par le BCG ou Mtb-individus exposés développera les fortes réactions TST et stratégies pour la classification et une manipulation des échantillons de TST non-répondeurs, ainsi qu’une sensibilisation cutanée préexistante dans la population étudiée, Il faut tenir compte avant d’entreprendre un essai de rappel à l’aide de cette méthode. Aussi, en échantillonnage SB et marquant visuel, il existe un potentiel pour un biais théorique chez les individus atteints de réponses réduite de la peau due à global ou liées à la peau atteinte immunité comme on le voit, par exemple, dans l’infection à VIH et de certains groupes d’âge2, 13,18,20. En outre, une stimulation immunologique des tests répétés sur la réaction au TCT est bien connu20,22. Toutefois, les phénotypes cellulaires de SB restent plutôt constantes lorsque TCT sont répétées10. Cette observation supporte le rôle de rappel SB dans des études longitudinales de la réponse immunitaire cellulaire.

Pour les immunologistes de lymphocytes, rappel SB permet pour la récolte des fractions élevées de cellules antigène-spécifiques. Cependant, le calendrier de SB pour un échantillonnage d’un PPD-dépôts est critique car tant la composition cellulaire et le microenvironnement de la cytokine changent avec le temps. Dans ce protocole, cloques ont été induit défi après 7 jours et les cellules isolées principalement CD4 + effectrices T-lymphocytes mémoires y compris les fractions élevées de cellules avec une co-expression d’IFN-γ, TNF-α et IL-2. Ces observations sont conformes à précédentes études qui décrivent comment T-cell activation, la prolifération et la différenciation se produit dans la peau de PPD-amorcé2,15,21. Des études cinétiques de SB chez les individus sensibilisés à la PPD suggèrent que la réponse très précoce de la peau est imprécise ; Cependant, déjà dans les premiers jours suivant le PPD-défi, la réponse devient dominée par les T-cellules CD4 + (les deux phénotypes de mémoire centrales en mémoire et processeur d’effets ont été décrits) et, après 3 jours, la réponse est dominée par des fractions hautes de PPD spécifique cytokines produisant des lymphocytes T CD4 +2,8,10,15,21. Cette réponse adaptative cytokine reste détectable pendant plus de 2 semaines2,8,10,23. Jour 7 post-TST semble être le point de temps optimal pour la collection de cytokine production memory CD4 + T-cellules2. Cependant, autres points dans le temps, bien sûr, peut-être pertinents selon l’antigène et la réponse d’intérêt. À noter, dans une étude, la réponse adaptative de la PPD a été signalée au max un peu plus tôt avec une diminution de la sécrétion de la cytokine pro-inflammatoire déjà à 5 jours post-TST10.

SB liquide contient des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires et autres protéines indiqués comme représentative de la peau microenvironnement15,24. Les études cinétiques ont montré que TNF-α et IFN-γ niveaux dans les fluide pic SB après 3 jours tout en crête de niveaux IL-2 après 7 jours,2,10, reflétant probablement la domination des réponses adaptatives à cette date ultérieure. Parce que les cellules SB ont été activées in vivo, ils présentent une haute cytokines spontanée, mais aussi un potentiel pour une version spécifique à la restimulation (figures 3 et 4).

Ce rapport se concentre sur l’immunité des lymphocytes CD4 +. Comme l’a démontré à la Figure 2, la majorité des T-cellules isolées étaient en effet CD4 +, alors qu’il n’y avait presque aucune CD8 + T-cellules d’aspiration blister de fluide. C’est en ligne avec d’autres études de SB PPD-rappel présentant de faibles proportions et une capacité migratoire inférieure de T-cellules CD8 + par rapport aux lymphocytes T CD4 + cellules2,8,10,23. Une autre caractérisation de la contribution de CD8 + serait préférable ; Cependant, c’est au-delà de la portée du présent rapport.

T-cellules sont considérés comme essentiels pour le contrôle immunitaire du Mtb; Toutefois, il a été difficile d’identifier un corrélat fiable de la protection dans la réponse immunitaire adaptative du sang25,26. Ce barrage routier entrave gravement le développement de nouveaux vaccins contre la tuberculose, comme il n’existe actuellement aucune alternative à l’efficacité de grandes et très coûteux essais27. Les développeurs de vaccin TB déterminent immunogénicité des vaccins par évaluer les changements dans les populations de lymphocytes de vaccins spécifiques dans le sang28,29petites et transitoires. Toutefois, il est douteux que la petite fraction des lymphocytes T spécifiques de l’antigène présent dans le sang en circulation est pertinente (c’est-à-direcapables de migrer vers le site des maladies infectieuses et représentant de la T-cellule-rich microenvironnement contrôle Mtb) 27 , 30 , 31 .

Basé sur des études antérieures et les données présentées ici, le modèle de rappel cutanée SB représente un potentiel inexploité pour l’étude des lymphocytes T spécifiques vaccin. Non seulement le modèle permet-il un rappel d’un vaccin réponse générée depuis des décennies, il permet également l’évaluation de la mémoire du vraie potentiel dans un contexte spécifique des tissus15,18,19,21. Roman, des tests cutanés spécifiques, qui comprennent des antigènes composés aussi des vaccins contre la tuberculose sous-unité candidat, suggèrent de nouvelles possibilités pour l’évaluation de vaccins à l’aide de ce modèle28,32. En outre, des analyses transcriptomiques suggèrent qu’une médiation réponse immunitaire cellulaire générée en peau de PPD-contesté est similaire à la réponse trouvée dans le VTT-infection pulmonaire18.

Alors que le poinçon biopsies de la peau aussi permettant une récolte de cellules de la peau et fournissent de l’information spatiale, par rapport à l’échantillonnage de SB, la méthode est plus invasive et nécessite un traitement enzymatique ou mécanique pour préparer des suspensions de cellules individuelles,33. Mesures de marqueurs de cytokines et de cellule sont comparables entre les deux méthodes2,10.

La méthode d’aspiration blister a déjà été appliquée dans de nombreux domaines de la recherche médicale en dehors de la dermatologie, seul ou en combinaison avec un défi systémique ou locale de la peau. Les exemples incluent des études de septicémie, maladie lymphoproliférative liée au virus Epstein – Barr, neuropathie diabétique, les effets de l’apport de glucocorticoïdes et essais humains test anticorps thérapeutiques ou modèles pour les thérapies de T-cellule-cible10 ,34,35,36,37,38.

D’un point de vue thérapeutique, la méthode de rappel cutanée SB offre des avantages uniques pour étudier la mémoire centrale de lymphocytes potentielle et -une fois biologique et technique point de vue-la peau semble fournir un échantillonnage pertinentes compartiment2, 15,18,19,21. En particulier, par rapport à l’échantillonnage passif traditionnel consistant à diffuser les PBMC, permet à la méthode de rappel cutanée SB pour l’étude des lymphocytes T qui ont prouvé la capacité de migrer à partir du ganglion lymphatique en réponse à leur antigène pertinente et remplissez la section locale expansion et la différenciation dans un tissu-spécifique en vivo contexte15,18,19,21.

En conclusion, le modèle a démontré ici pourrait être pertinente pour des chercheurs dans le domaine de l’immunité adaptative humaine et agents ciblage de cellules T (c.-à-d., dans la recherche de vaccinologie ou cancer maladies infectieuses). Le modèle TST appliqué dans le présent protocole est, bien entendu, une importance particulière dans le domaine de la vaccinologie TB. Cependant, le concept de base de ce modèle est très applicable dans d’autres domaines de la recherche.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Mads Radmer Jensen pour ses conseils pratiques et académiques ; Lau Lindqvist et Kaare Svejstrup pour fournir une expertise technique ; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt et Harpøth W. Solveig pour leur assistance technique ; le personnel de la clinique de Gentofte TB pour leur formation en administration de PPD ; et tous les bénévoles pour avoir participé à l’étude. Ce projet est financé par le programme européen Commission H2020 [numéro de licence TBVAC2020 643381], et nous tenons à remercier les partenaires du consortium des échanges fructueux.

Materials

Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091
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Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).
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