Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo
Summary
Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.
Abstract
Apesar de numerosos estudos que tentam desenvolver modelos animais confiáveis que refletir o primário processa neurodegeneração subjacente, muito poucos foram amplamente aceites. Aqui, propomos um novo procedimento adaptado de conhecidos ex vivo cérebro fatia técnica, que oferece um mais perto na vivo-como cenário do que em vitro preparações para investigar os eventos iniciais provocando degeneração celular, como observada na doença de Alzheimer (AD). Esta variação consiste em etapas simples e facilmente reproduzíveis, que permitem a preservação do cytoarchitecture anatômica da região selecionada do cérebro e sua funcionalidade local em um ambiente fisiológico. Diferentes áreas anatômicas podem ser obtidas o mesmo cérebro, proporcionando a oportunidade de realizar várias experiências com os tratamentos em questão em um local-, dose e tempo-dependente. Limitações potenciais que poderiam afetar os resultados relacionados com esta metodologia estão relacionadas com a conservação do tecido, ou seja, a manutenção da sua integridade anatômica durante as etapas de corte e a incubação e a espessura de corte, que pode influenciar a análise bioquímica e imuno-histoquímica. Esta abordagem pode ser utilizada para diferentes fins, tais como explorar mecanismos moleculares envolvidos em condições fisiológicas ou patológicas, triagem de drogas ou ensaios de dose-resposta. Finalmente, este protocolo também poderia reduzir o número de animais utilizados em estudos comportamentais. O aplicativo aqui relatado foi recentemente descrito e testado pela primeira vez na ex vivo fatias cérebro rato contendo o prosencéfalo basal (BF), que é uma das regiões cerebrais afetadas principalmente no AD. Especificamente, foi demonstrado que a administração de um peptídeo tóxico derivado do C-terminal da acetilcolinesterase (AChE) poderia solicitar um AD-como o perfil, provocando, ao longo do eixo antero-posterior do BF, uma expressão diferencial de proteínas alteradas na AD, como o receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada Tau (p-Tau) e beta amiloide (Aβ).
Introduction
AD é que uma patologia crônica caracterizada por imparidade neurodegenerativa progressiva, afetando áreas diferentes do cérebro, tais como o córtex entorhinal (CE), BF, hipocampo (HC) e bulbo olfatório (OB)1,2,3, 4,5. Estágios finais de desenvolvimento AD conduzem a um progressivo declínio cognitivo, tornando esta doença, a forma mais comum de demência, representando aproximadamente 70% de todos os casos6. Apesar das tentativas extensas para entender os estágios iniciais, causando AD, não há atualmente uma indicação experimental definida elucidá-los. Além disso, a teoria mais popular – a “hipótese amiloide” – é cada vez mais questionada desde que ele não fornece um perfil completo em explicar o Patobiológico AD, nem um alvo farmacêutico que se revelou eficaz7,8 ,9.
Uma teoria alternativa que está recebendo atenção crescente sugere que os mecanismos iniciais ocorrem durante neurodegeneração estão relacionados a um cluster neuronal principalmente sensível no AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. este hub celular heterogênea englobada no âmbito dos projectos BF, mesencéfalo e tronco cerebral, para várias regiões, tais como o CE, HC e OB15,16. Apesar de sua diversidade na morfologia neuronal e síntese de neurotransmissor, esse núcleo de células compartilha uma característica comum em expressar a dor, que também pode ter uma função não-enzimática de17,18. Este papel não-clássica como um romance de sinalização molécula Medeia o fluxo de cálcio (Ca2 +) em neurônios que pode passar por eventos tróficos ou tóxicos em relação à dose de Ca2 + , disponibilidade e idade neuronal17,18 , 19.
Durante neurodegeneração, a perda celular observada pode ser, portanto, associada a esta função não enzimáticos17,18,20, que é atribuível a um peptídeo 30mer (T30) clivado de dor C-terminal 20. em consonância com os resultados anteriores, realizados na cultura de pilha e óptico de imagem18,21 preparações, temos demonstrado, através de uma nova abordagem baseada em ex vivo fatias cérebro rato contendo estruturas BF, que induziu T30 um perfil AD22. Especificamente, esta nova metodologia oferece um cenário mais fisiológico do que cultura celular desde que ele mantém muitas das características de um tecido intacto, variando de anatômica para preservação de circuitos, embora para uma janela de tempo de horas. Aplicamos este protocolo para explorar os eventos que ocorrem durante as primeiras fases de neurodegeneração, monitoramento da resposta aguda a T30 pedido.
Apesar da grande corpus de literatura sobre o uso do cérebro fatias para investigar as vias moleculares implícita no dano neuronal ou neurogênese23,24, este protocolo fornece pela primeira vez uma mais imediata e sensível à leitura comparada para o uso comum de organotypic fatias. No entanto, como é o caso de organotypic seções do cérebro, este procedimento de fatia aguda pode também ser adotado para fins diversos, tais como a avaliação de neuroprotective ou moléculas neurotóxicas, descoberta de mudanças moleculares primárias que ocorrem em um processo específico, a análise imuno-histoquímica e ensaios farmacológicos para o sistema nervoso central relacionadas com patologias.
Protocol
Representative Results
Discussion
O principal aspecto do presente protocolo, baseado na técnica cérebro bem-estabelecida ex vivo , permite testar sincronicamente duas hemislices especulares, obtidas no mesmo plano anatômico, monitorando sua resposta após a aplicação de um determinado condição (controlar ou tratados); Este, portanto, oferece uma paradigma experimental tão rigidamente controlada quanto possível. A possibilidade de avaliar em um tempo – dose- e site-specific maneira diferente neuroquímicos relacionados com comprometiment…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Neuro-Bio Ltd. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Giovanni Ferrati e Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) para seus comentários e conselhos sobre o manuscrito.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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