Альтернативный подход к изучению основных событий в нейродегенеративные, используя срезы мозга крысы Ex Vivo
Summary
Мы представляем метод, который может обеспечить дальнейшее понимание в начале события, лежащие в основе нейродегенеративные и на основании установленных экс vivo мозга технику, сочетая преимущества в vivo и in vitro экспериментов. Кроме того он представляет собой уникальную возможность для прямого сравнения обработанных и необработанных группы в той же анатомические плоскости.
Abstract
Несмотря на многочисленные исследования, которые пытаются разрабатывать надежные Животные модели, которая отражает основной обрабатывает базовый нейродегенеративные очень немногие были широко приняты. Здесь, мы предлагаем новую процедуру адаптировано из известных ex vivo мозга ломтик метод, который предлагает ближе в естественных условиях-как сценарий чем в vitro препараты, для расследования раннего события, вызывая дегенерации клеток, как наблюдается при болезни Альцгеймера (AD). Этот вариант состоит из простых и легко воспроизводимые шаги, позволяющие сохранение анатомические cytoarchitecture области выбранной мозга и его местные функциональность в физиологических условиях. Различных анатомических областей можно получить от же мозга, предоставляя возможность выполнить несколько экспериментов с лечения в вопросе в сайт, доза и время зависимых манере. Потенциальные ограничения, которые могут повлиять на результаты, связанные с этой методологии относятся к сохранению ткани, т.е. поддержание ее анатомической целостности во время нарезки и инкубации шаги и толщина среза, который могут влиять на биохимические и иммуногистохимической анализ. Этот подход может применяться для различных целей, таких как изучение молекулярных механизмов, участвующих в физиологических и патологических условий, наркотиков скрининг или анализов доза ответ. Наконец этот протокол может также уменьшить количество животных, используемых в поведенческих исследований. Приложение, сообщили здесь недавно описал и испытаны в первый раз на мозг ex vivo крыса фрагменты, содержащие базальной переднего (BF), который является одним из мозгового регионов, наиболее пострадавших в AD. В частности было продемонстрировано, что администрация токсичных пептид, производный от C-конечная ацетилхолинэстеразы (АВО) может побудить AD-как профиль, запуска, Антеро задней оси BF, дифференциальной выражение белки, изменены в AD, таких как alpha7 никотиновых рецепторов (α7-nAChR), фосфорилированных Тау (p Тау) и бета амилоида (значения).
Introduction
Объявление является хронической патологии характеризуется постепенным нейродегенеративных обесценения, затрагивающих различные мозга областях, таких как entorhinal коры (EC), BF, гиппокамп (HC) и обонятельные луковицы (OB)1,2,3, 4,5. На поздней стадии развития AD привести к прогрессивным когнитивными, делая это заболевание наиболее распространенной формой слабоумия, приходится приблизительно 70% всех случаев6. Несмотря на обширные попытки понять на начальных этапах, вызывая AD не является в настоящее время определенных экспериментальной индикация, выяснения их. Кроме того все больше и больше под сомнение наиболее популярная теория – «амилоида гипотеза» – так как он не обеспечивает полного профиля в объяснении AD pathobiology, ни фармацевтических целевой объект, который оказался эффективным7,8 ,9.
Альтернативная теория, которой уделяется все большее внимание свидетельствует о том, что первоначальные механизмы, происходящих во время нейродегенеративные связаны к кластеру нейрональных главным образом подвержены в AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. Этот гетерогенных сотовой концентратор, охватываются BF, среднего мозга и ствола мозга, проекты для нескольких областей, таких, как ЕК, HC и OB15,16. Несмотря на многообразие в нейрональных морфологии и синтеза нейромедиаторов это ядро клетки акций общей чертой выразить боль, которая может также иметь неферментативного функция17,18. Эта неклассических роль как Роман сигнальные молекулы опосредует потока кальция (Ca2 +) в нейроны, которые могут пройти трофических или токсичных события по отношению к Ca2 + дозы, доступность и нейрональных возраст17,18 , 19.
Во время нейродегенеративные наблюдается потеря сотовой могут быть таким образом связаны этой неферментативного функция17,18,20, который присваивается 30mer пептид (T30) расщепляется от боль-C-terminus 20. с учетом предыдущих результатов, на культуры клеток и оптических изображений препаратов21 18,, мы продемонстрировали, через новаторский подход, основанный на мозг ex vivo крыса ломтиками, содержащий BF структуры, которые T30 AD-как профиль22. Конкретно эта новая методология предлагает более физиологических сценарий чем культуры клеток, так как он поддерживает многие из характеристик неповрежденной ткани, начиная от анатомических сохранение схемы, хотя для окно времени часов. Мы применили этот протокол для изучения событий, происходящих на ранних этапах нейродегенеративные, мониторинг острой реакции после T30 приложения.
Несмотря на большое количество литературы по использованию мозга ломтики расследовать молекулярные пути подразумевается в нейрональных ущерб или нейрогенез23,24, этот протокол обеспечивает в первый раз более непосредственный и чувствительных, зачитывает по сравнению для общего пользования organotypic ломтиками. Однако как и в случае для organotypic участков мозга, эта процедура острый срез могут также быть приняты для нескольких целей, например для оценки нейропротекторной или нейротоксическое молекул, обнаружение первичных молекулярных изменений, происходящих в рамках определенного процесса, Иммуногистохимический анализ и фармакологических проб для центральной нервной системы, связанных патологий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Основной аспект настоящего Протокола, на основе устоявшихся ex vivo мозга техника, позволяет синхронно протестировать два зеркальные hemislices, полученные из той же анатомические плоскости, мониторинг их ответ после применения конкретных условие (контроль или лечение); Это поэтому пред?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась нейро-био Ltd. Мы хотели бы поблагодарить д-р Джованни Ferrati и д-ром Серхио Ротондо (нейро-био) за их комментарии и советы по рукописи.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
Referencias
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neurociencias. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociencias. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
